袁旭，伍小宇，李偉麗，王慶慧，劉平，林洪斌，車振明，吳韜

(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)

郫縣豆瓣主產(chǎn)于四川省成都市郫都區(qū)(原郫縣)，是中國地理標(biāo)志產(chǎn)品。它以紅辣椒、蠶豆、小麥粉為主要原料，通過微生物制曲、前發(fā)酵，再經(jīng)過翻、曬、露等后發(fā)酵工藝釀制而成，其制作技藝已經(jīng)列入國家級非物質(zhì)文化遺產(chǎn)名錄[1]。郫縣豆瓣具有色澤紅褐油潤、瓣粒香脆、味鮮辣及醬酯香等特點(diǎn)，是川菜食譜中最常用的調(diào)味品之一，被譽(yù)為“川菜之魂”。

以往研究表明，發(fā)酵調(diào)味品不僅具有獨(dú)特的感官特征，還具有顯著的生理活性。例如日本納豆是以大豆為原料，經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵后制成，具有抗癌、溶解血栓、降血壓、抗氧化、抗菌等多種生物活性[2]。盡管郫縣豆瓣距今已有300多年的歷史，對它的研究還主要集中在發(fā)酵菌群、風(fēng)味成分、辣度及生產(chǎn)工藝等方面，而對其營養(yǎng)成分及功能活性研究極少。在國標(biāo)GB/T 20560—2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品郫縣豆瓣》中，僅針對郫縣豆瓣的水分、氨基酸態(tài)氮、總酸、食用鹽、酸價及過氧化值這些理化指標(biāo)提出了規(guī)范要求[3]。多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚羥基結(jié)構(gòu)的次生代謝物，包括酚酸、黃酮、單寧等化合物。其結(jié)構(gòu)中的鄰位酚對活性氧等自由基具有很強(qiáng)的捕捉能力, 這使得多酚類成分通常具有較強(qiáng)的抗氧化性以及清除自由基的能力。近年來許多學(xué)者亦認(rèn)為經(jīng)常攝入含有植物多酚的食物，與降低癌癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎等慢性病的發(fā)病率具有密切相關(guān)性[4]。

隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的日益提高，人們對調(diào)味品的要求已不再僅限于吃飽吃好，而是將風(fēng)味、營養(yǎng)與預(yù)防疾病等需求統(tǒng)一聯(lián)系起來。本文擬通過對市場上郫縣豆瓣醬的營養(yǎng)、多酚類成分及抗氧化活性進(jìn)行初步評價，以期為今后郫縣豆瓣醬工藝改進(jìn)，標(biāo)準(zhǔn)提高及相關(guān)功能食品開發(fā)等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種不同品牌郫縣豆瓣醬2017年5月購于成都超市。沒食子酸、抗壞血酸、蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、三吡啶三吖嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)，美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

K1100型全自動凱氏定氮儀、SOX406型脂肪測定儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，奧地利Molecular Devices公司；TD-5M型離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；萬能高速粉碎機(jī)，深圳尼嘉商貿(mào)有限公司；Heto-HSC500真空冷凍干燥機(jī)，上海佰蕾真生物科技有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取50 g供試樣品置于-50 ℃真空冷凍干燥機(jī)24 h，干燥后用高速粉碎機(jī)將豆瓣粉碎，盛裝在潔凈密封袋中，備用。

1.3.2 化學(xué)成分測定

1.3.2.1 脂肪的測定[5]

所有樣品脂肪含量的測定均按GB/T 5009.6—2003規(guī)定的方法，采用索氏抽提法。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)測定[6]

所有樣品蛋白質(zhì)含量的測定均按GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》規(guī)定的方法，采用凱氏定氮法。

1.3.2.3 灰分測定[7]

所有樣品灰分含量的測定均按GB 5009.4—2016規(guī)定的方法，采用灼燒法。

1.3.3 樣品提取液制備[8]

稱取待測豆瓣樣品粉末2 g加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，于50 ℃、70 W超聲波提取30 min，4 000 r/min離心15 min，取上層清液5 mL過0.45 μm濾膜，濾液待測。

1.3.4 總黃酮含量的測定[9]

采用AlCl3-NaOH-NaNO2法測定樣品中總黃酮的含量。取50 μL樣品提取液與20 μL 0.5 mol/L NaNO2溶液于96微孔板中，室溫孵育5 min后，加入20 μL 0.3 mol/L AlCl3·6H2O溶液室溫旋轉(zhuǎn)孵育6 min，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液旋轉(zhuǎn)混合均勻，于波長510 nm處測吸光度，讀數(shù)前搖動微孔板30 s。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(0～0.5 mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.046 22+1.428 83x，R2=0.999 11)。結(jié)果以毫克蘆丁當(dāng)量每克干物質(zhì)計(mg蘆丁當(dāng)量/g)。

1.3.5 總多酚含量的測定[10]

采用Folin-Ciocalteu法測定樣品中的總多酚含量。取25 μL樣品與125 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的福林酚試劑于96微孔板中，輕輕旋轉(zhuǎn)微孔板使其混勻，靜置8～10 min，然后加入125 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的Na2CO3溶液，避光反應(yīng)30 min，于波長765 nm處測吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品(0～300 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.111 94+0.006 66x，R2=0.998 63)，結(jié)果以毫克沒食子酸當(dāng)量每克干物質(zhì)計(mg GAE/g)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定[11]

用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液將樣品提取液分別按2、4、8、16、32倍進(jìn)行稀釋。吸取50 μL稀釋后的樣品與200 μL 0.5 mmol/L新鮮配制的DPPH溶液(60%乙醇)于96微孔板中，在酶標(biāo)儀上振蕩10 s混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測吸光度。以水溶性抗壞血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DPPH自由基清除能力按下列公式計算：

(1)

式中：ACDPPH，DPPH自由基清除能力，%；Aa，DPPH與體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇混合液的吸光度；Ab，60%乙醇與樣品混合液的吸光度；As，DPPH與樣品混合液的吸光度。

1.3.7 還原能力的測定[12]

采用鐵離子還原能力(Ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)法測定不同樣品提取液中總抗氧化能力。配制10 mmol/L TPTZ溶液：稱取0.031 23 g TPTZ，用40 mmol/L鹽酸溶液定容至10 mL；配制FRAP工作液：由0.3 mol/L pH 3.6醋酸緩沖液，20 mmol/L三氯化鐵溶液和10 mmol/L TPTZ溶液按10∶1∶1(體積比)組成，臨用前混合。取100 μL樣品于反應(yīng)管中，加入3 mL FRAP工作液，混勻后置于37 ℃水浴10 min，分別吸取200 μL 混合液于96微孔板中，于波長593 nm處測吸光度。以水溶性抗壞血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.072 06+0.000 65x，R2=0.999 64)，結(jié)果以微摩爾水溶性抗壞血酸當(dāng)量每克干物質(zhì)計(μmol VC/g)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)成分含量分析

在微生物發(fā)酵過程中，豆瓣原料中的一些蛋白會被降解，而有些新蛋白會被合成。因此豆瓣醬中蛋白質(zhì)含量是原料中蛋白質(zhì)總量與微生物代謝總量的綜合反映。由表1可以看出，不同品牌豆瓣醬的蛋白質(zhì)含量的變化為5.14%～16.98%，除2號與6號樣品之間無顯著差異外(p>0.05)，其余豆瓣醬樣品蛋白質(zhì)含量均存在顯著性差異(p<0.05)。

表1 不同品牌豆瓣醬中脂肪、蛋白質(zhì)、灰分含量Table 1 Fat, protein and ash contents in differentbean pastes

注：同列肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

豆瓣醬中的脂肪主要來源于原料中的蠶豆、辣椒和面粉，以及外加的辣椒紅油。其脂肪含量的變化為2.26%～23.51%。除了8號與9號、4號與5號、2號與3號之間無顯著性差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)，此外，紅油豆瓣(1～7號樣品)脂肪含量顯著高于老豆瓣(8～10號樣品)，這是因?yàn)榧t油豆瓣在工藝中加入了辣椒紅油。

灰分是標(biāo)示食品中無機(jī)成分總量的一項(xiàng)指標(biāo)。由表1可以看出郫縣豆瓣醬中的灰分含量的變化為3.74%～4.81%，除1號和2號，3、9和10號樣品之間無顯著性差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)，所有樣品的灰分含量均在3%以上，主要來源于生產(chǎn)過程中加入的食鹽以及豆瓣醬原料中的無機(jī)鹽等。

2.2 總多酚、總黃酮含量分析

豆瓣醬的總多酚含量的范圍為2.290～5.385 mg沒食子酸當(dāng)量/g，其含量最高值約為最低值的2.4倍?？傸S酮含量的范圍為0.660～2.298 mg蘆丁當(dāng)量/g，其含量最高值約為最低值的3.5倍。

2.3 抗氧化活性評價

2.3.1 DPPH自由基清除能力評價

分別配制不同濃度的豆瓣樣品，并測定其對DPPH自由基的清除率，根據(jù)每個樣品不同濃度對DPPH自由基清除率，繪制DPPH自由基清除能力曲線圖(圖1)。ICDPPH 50值表示降低DPPH初始吸光度值50%所需的樣品的濃度(mg/L)，ICDPPH 50值越小，表示其清除自由基的能力越強(qiáng)，即抗氧化活性越強(qiáng)。由圖1可知，同一豆瓣醬樣品隨著提取物濃度的增大，其DPPH自由基清除能力逐漸增大。除10號與7號、9號，2號與6號的ICDPPH 50值之間無顯著差異外(p>0.05)，其余均有顯著性差異(p<0.05)。本實(shí)驗(yàn)以天然抗氧化劑水溶性VC作為對照，其ICDPPH50值為4.724×10-3mg/mL，而不同品牌豆瓣醬ICDPPH50值最小值為7.662 mg/mL，表明各樣品的清除自由基的能力均顯著弱于Vc，不同品牌抗氧化能力由大到小依次為：7號、10號、9號、1號、6號、2號、3號、8號、5號和4號。

圖1 不同濃度豆瓣醬提取物對DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging effects of extracts various concentrations from bean paste

2.3.2 還原能力評價

由表2可知，豆瓣醬的FRAP值(氧化鐵還原能力)的變化范圍為11.474～45.967 μmol VC/g，除了4號、5號與3號、6號，8號與6號，7號、1號與3號、10號，9號與3號無顯著性差異(p>0.05)外，其余均有顯著性差異(p<0.05)。FRAP值越大，其抗氧化性越強(qiáng)，因此10種品牌豆瓣醬抗氧化能力由大到小依次為：10號、1號、7號、3號、9號、2號、5號、4號、6號、8號。

表2 豆瓣醬提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性Table 2 Total polyphenol and flavonoid contents and antioxidant activities of extracts from bean paste

續(xù)表2

試驗(yàn)號總黃酮含量/(mg蘆丁·g-1)總多酚含量/(mg GAE·g-1)ICDPPH 50值/(mg·mL-1)FRAP值/(μmol VC·g-1)72.298±0.127g5.385±0.140f7.662±0.248a40.694±4.204ef80.823±0.155ab2.290±0.128a32.766±1.248f11.474±1.018a92.141±0.122fg5.211±0.166f10.851±0.888b30.797±3.985d102.046±0.184f5.128±0.115f9.396±0.274ab45.967±6.376f

注：同列肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

為比較豆瓣中總黃酮、總多酚含量與其抗氧化關(guān)系，采用Pearson′s方法進(jìn)行相關(guān)分析，由于ICDPPH 50值越小，表示其抗氧化活性越強(qiáng)，因此采用ICDPPH 50倒數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如表3所示，總黃酮、總多酚含量與DPPH自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)，與還原能力之間呈極顯著相關(guān)，其中總黃酮含量與DPPH自由基清除能力、還原能力之間的相關(guān)系數(shù)r分別為0.727和0.867；相關(guān)性分析顯示，還原能力與總黃酮含量和總多酚含量均具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.867和0.866；DPPH自由基清除能力與總黃酮、總多酚含量的相關(guān)性系數(shù)r分別為0.727和0.714，以上數(shù)據(jù)表明多酚、黃酮類物質(zhì)是豆瓣醬中主要的抗氧化劑。

表3 不同品牌豆瓣醬提取物的總黃酮、總多酚含量 與抗氧化活性相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between total phenolic and flavonoid contents and antioxidant activities from different extracts of bean pastes

注：*顯著相關(guān)(p<0.05)；**極顯著相關(guān)(p<0.01)。

3 討論

3.1 不同品牌郫縣豆瓣醬營養(yǎng)成分之間差異

本研究發(fā)現(xiàn)不同品牌的郫縣豆瓣醬的蛋白質(zhì)、脂肪含量差異極顯著，例如4號樣品的蛋白質(zhì)含量僅為10號樣品的42%，而脂肪含量是10號的3.4倍。這種顯著差異一方面在于原料成分存在差異，另一方面可能在于這2種豆瓣醬的制造工藝不同。10號樣品為采用傳統(tǒng)工藝加工的豆瓣醬，發(fā)酵周期在1年以上，俗稱老豆瓣。而4號樣品為紅油豆瓣醬，其發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)工藝類似，但是發(fā)酵周期較短，一般僅為3個月。此外，紅油豆瓣醬還會加入植物油進(jìn)行封存。目前國標(biāo)GB/T 20560—2006及第1號修改單雖然提到豆瓣醬可以加入植物油封存，但未對郫縣豆瓣的加油量進(jìn)行規(guī)定，因而不同品牌的紅油豆瓣的加油量可能存在較大差異，進(jìn)而會對郫縣豆瓣的營養(yǎng)成分產(chǎn)生顯著影響。本研究首次對郫縣豆瓣的營養(yǎng)成分進(jìn)行評估，為今后豆瓣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)與提升奠定了基礎(chǔ)。

3.2 郫縣豆瓣的多酚和黃酮含量與抗氧化活性之間的關(guān)系

本研究采用DPPH自由基清除方法，F(xiàn)RAP總抗氧化能力方法評價了不同豆瓣的抗氧化活性，2種方法采用了抗壞血酸作為參照，為不同研究結(jié)果之間進(jìn)行比較提供了參考。此外總黃酮、總多酚含量與DPPH自由基清除能力之間呈顯著正相關(guān)(r分別為0.727、0.714)，與FRAP總抗氧化能力之間呈極顯著相關(guān)(r分別為0.867、0.866)，表明多酚、黃酮類物質(zhì)可能是豆瓣醬中主要的抗氧化成分。

4 結(jié)論

本研究首次針對郫縣豆瓣醬的營養(yǎng)成分(蛋白質(zhì)、脂肪、灰分)、功能成分(總多酚、總黃酮)含量以及體外抗氧化活性進(jìn)行評價。研究結(jié)果表明，不同品牌豆瓣醬中的蛋白質(zhì)、脂肪、灰分的含量存在顯著差異，其不僅與原料有關(guān)，還可能與郫縣豆瓣加工工藝有關(guān)。此外郫縣豆瓣具有顯著的抗氧化活性，多酚、黃酮類物質(zhì)可能是豆瓣醬中主要的抗氧化物質(zhì)。未來還需要采用分離純化手段進(jìn)一步明確郫縣豆瓣的多酚、黃酮類物質(zhì)的詳細(xì)組成。本文為今后郫縣豆瓣醬工藝改進(jìn)，郫縣豆瓣相關(guān)功能食品開發(fā)等提供理論支持。