曾橋，韋承伯，夏飛，李祥

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)2(陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安，710021) 3(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安，710021)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲[1](Eucommia ulmoides oliver)的干燥葉，常于夏、秋二季枝葉茂盛時(shí)采收，曬干或低溫烘干?！吨袊?guó)藥典》記載其性微辛、溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨的作用，臨床上常用于治療肝腎不足，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸痛，筋骨痿軟等癥[2]。綠原酸是杜仲葉中的重要活性成分，是評(píng)價(jià)杜仲葉質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要指標(biāo)[2]，現(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸具有抗氧化[3]、抑菌[3-4]、保護(hù)心血管[5]、降血糖[6]、降血脂[7]、抗病毒[8]、抗白血病[9]、抗癌[10]等一系列生物活性，在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域具有廣泛的用途。杜仲葉中綠原酸含量因產(chǎn)地和收獲時(shí)間而異，一般可達(dá)1%～5%，一些品質(zhì)較好的杜仲葉，其綠原酸含量和金銀花相當(dāng)[11]。2018年4月24日國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《關(guān)于征求將黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)管理意見》的函，提出將杜仲葉按照藥食同源物質(zhì)進(jìn)行管理，有望在未來進(jìn)一步拓寬杜仲葉的使用范圍，從而極大地促進(jìn)杜仲葉資源的開發(fā)和利用。

茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，是近年來茶品市場(chǎng)興起的一個(gè)新熱點(diǎn)，由于其內(nèi)質(zhì)金花普茂，菌香濃郁，開湯后湯色紅濃，滋味醇和，香氣純正[12]，且具有較好的消食健胃、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等[13-14]功效，受到消費(fèi)者的青睞。本文前期以采摘于陜西漢中略陽的杜仲葉為原料，經(jīng)殺青、揉捻、干燥等制成杜仲葉茶，進(jìn)一步采用茯磚茶加工工藝制作而成杜仲葉茯磚茶，屬于一種新型茶，目前尚未見杜仲葉茯磚茶功能成分和活性研究的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉茯磚茶：所用杜仲葉為2017年5月采摘于陜西漢中略陽，經(jīng)陜西科技大學(xué)藥學(xué)系鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥葉，由陜西樸道茯茶股份有限公司加工制成杜仲葉茯磚茶。

乙腈(色譜純),默克股份兩合公司；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、α-胰淀粉酶(13 U/mg)、α-葡萄糖苷酶(32 U/mg)、阿卡波糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),上海源葉生物科技有限公司；H3PO4、NaCl、FeCl3、乙酸乙酯、淀粉、NaOH、Na2CO3、NaH2PO4、Na2HPO4、鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、抗壞血酸(Vc)、無水乙醇、95%乙醇,天津市天力化學(xué)試劑有限公司；HCl、3,5-二硝基水楊酸、4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸,上海山浦化工有限公司；D101型大孔樹脂,天津允開樹脂科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoU3000高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和Chromeleon 7.10色譜工作站)、Varioskan flash酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TU-1810紫外分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004N電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司；EX125DZH電子天平,奧豪斯儀器(常州)有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠； KH5200DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司；TD5A大容量低速離心機(jī),長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；DZ-2BC型真空干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取杜仲葉茯磚茶1塊(500 g)，粉碎過60目篩，置于50 ℃真空干燥箱中干燥至恒重后，準(zhǔn)確稱取杜仲葉茯磚茶粉末2 g，置于一定濃度乙醇溶液中，在一定溫度、液料比、超聲功率下提取一定時(shí)間后過濾，濾液定容至100 mL，進(jìn)一步吸取2 mL定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，得杜仲葉茯磚茶綠原酸供試品溶液。

1.3.2 綠原酸含量測(cè)定

1.3.2.1 色譜條件[2]

色譜柱：Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(0.4% H3PO4水溶液)=13∶87；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm。

1.3.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品20.922 mg，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，得質(zhì)量濃度為836.9 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別配制成質(zhì)量濃度為4.185、8.369、16.738、41.845、83.690 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用HPLC法進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程為Y=0.531 7X+0.239 6，R2=0.999 9，線性關(guān)系良好。

1.3.2.3 供試品溶液綠原酸含量測(cè)定

取供試品溶液，采用HPLC法按1.3.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算峰面積，依綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算綠原酸含量。

1.3.2.4 綠原酸得率計(jì)算

(1)

式中：Y為綠原酸質(zhì)量濃度，μg/mL；V為供試品溶液體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；B為原料質(zhì)量，g；106為質(zhì)量換算系數(shù)。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取杜仲葉茯磚茶試樣2 g置于100 mL錐形瓶中，在液料比25∶1(mL∶g)、提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%對(duì)綠原酸得率的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1(mL∶g)對(duì)綠原酸得率的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、 液料比25∶1(mL∶g)、提取溫度60 ℃、超聲功率60 W條件下，考察提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70 min對(duì)綠原酸得率的影響；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取時(shí)間30 min、超聲功率60 W條件下，考察提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃對(duì)綠原酸得率的影響；在乙醇濃度為50%、液料比25∶1(mL∶g)、提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃條件下，考察超聲功率分別為40、50、60、70、80、90、100 W對(duì)綠原酸得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化杜仲葉茯磚茶綠原酸提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定超聲功率為90 W，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度等4個(gè)因素，利用Design Expert 8.0.6軟件，設(shè)計(jì)4因素3水平Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 杜仲葉茯磚茶綠原酸的純化[15]

將D101大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h后，去離子水洗至無醇味，進(jìn)一步用體積分?jǐn)?shù)5% HCl溶液提取12 h，去離子水洗至中性；然后用質(zhì)量濃度為50 g/L 的NaOH溶液提取12 h，去離子水洗至中性；最后用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇洗滌，水洗至中性后備用。將預(yù)處理后的D101大孔樹脂濕法裝入離子交換柱，將在最優(yōu)提取工藝條件下提取的綠原酸提取液離心(4 000 r/min)15 min，取上清液，用濃HCl調(diào)至pH=2，自離子交換柱上端倒入柱中，進(jìn)行動(dòng)態(tài)分離，調(diào)節(jié)去離子水為pH=2，沖洗3～5 BV(樹脂體積)洗脫以去除雜質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇洗脫綠原酸。上樣、洗柱、洗脫速度均為2 BV/h。

將洗脫所得綠原酸溶液55 ℃減壓濃縮至質(zhì)量濃度約為40 mg /mL，采用乙酸乙酯按酯相和水相為1∶1萃取5次，每次萃取20 min，合并萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，采用去離子水復(fù)溶，冷凍干燥得純化后的綠原酸，經(jīng)HPLC檢測(cè)，綠原酸純度為30.31%。

1.3.6 降血糖作用研究

1.3.6.1 ɑ-胰淀粉酶抑制活性的測(cè)定[16]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，溶于NaCl濃度為6 mmol/L的20 mmol/L pH 6.9的磷酸鈉緩沖液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL的綠原酸溶液。于各試管中分別加入上述不同質(zhì)量濃度的綠原酸溶液200 μL與200 μL α-淀粉酶溶液(1.0 U/mL，溶于pH 6.9的磷酸鈉緩沖液)混合，記為樣品；以緩沖液代替酶溶液記為背景；用含NaCl的緩沖液代替樣品溶液記為陰性對(duì)照。所有試管溶液于37 ℃水浴孵育10 min后加入400 μL 2.5 g/L的淀粉溶液，置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min后加入1.0 mL DNS顯色劑(1% 3,5-二硝基水楊酸、12%酒石酸鉀鈉共同溶于0.4 mol/L NaOH)終止反應(yīng)，沸水浴10 min 后冷卻至室溫，加入10 mL蒸餾水稀釋，以緩沖液調(diào)零，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品、背景、陰性對(duì)照的吸光度值，分別記為A樣品、A背景和A陰性。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，按下式計(jì)算樣品對(duì)α-胰淀粉酶的抑制率：

(2)

1.3.6.2 ɑ-葡萄糖苷酶的抑制活性的測(cè)定[16-17]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，溶于40%乙醇溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL的溶液，在96孔板中，分別加入20 μL的綠原酸溶液與40 μL 5 mmol/L的4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷溶液(溶于pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液)，在37 ℃下孵育5 min后，分別加入10 μL 1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液(溶于pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液)，振蕩均勻，37 ℃下反應(yīng)10 min后加入140 μL 0.2 mmol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，得待測(cè)樣品。同時(shí)以緩沖液代替酶溶液，以40%乙醇溶液代替綠原酸溶液，其余操作條件同樣品，分別記為背景和空白對(duì)照。于400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品、背景、空白對(duì)照的OD值，分別記為A樣品、A背景和A空白。以阿卡波糖為陽性對(duì)照，用以下公式計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率：

(3)

1.3.7 抗氧化活性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除活性測(cè)定[18]

稱取一定量DPPH粉末，用無水乙醇配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液。稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，分別配制質(zhì)量濃度為4、8、12、16、20、24 μg/mL的溶液。取6支潔凈具塞試管，分別依次加入DPPH溶液2 mL，各濃度梯度杜仲葉茯磚茶綠原酸溶液2 mL，混勻后室溫放置30 min，以蒸餾水調(diào)零，于517 nm處測(cè)吸光度記為A樣品。用蒸餾水代替DPPH溶液按上述方法處理測(cè)定吸光度記為A對(duì)照，以蒸餾水代替杜仲葉茯磚茶綠原酸提取液按上述方法處理測(cè)定吸光度記為A空白。同時(shí)，以VC為陽性對(duì)照。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率：

(4)

1.3.7.2 鐵還原力測(cè)定[19]

稱取一定量純化后的杜仲葉茯磚茶綠原酸，分別配制質(zhì)量濃度為0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL的溶液，分別取各梯度濃度綠原酸溶液0.5 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液、5 mL蒸餾水和1 mL 0.1% FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min，以無水乙醇代替綠原酸提取液按上述處理作空白對(duì)照，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖1可知，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化先增大后減小，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大值，繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，綠原酸得率則開始下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，下降最為明顯。雖然增大乙醇體積分?jǐn)?shù)有利于綠原酸的溶出，但過大，易造成雜質(zhì)的溶出，削弱綠原酸的溶出，從而導(dǎo)致綠原酸提取率下降[20]。因此，適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fubrick tea

2.1.2 液料比對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖2可知，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率先隨液料比增加而增大，當(dāng)液料比達(dá)到25∶1 (mL∶g)時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大值2.376 2%，繼續(xù)增大液料比，綠原酸得率則開始下降。這是由于液料比的增加有利于增大綠原酸的絕對(duì)溶出量，但是過大的液料比也會(huì)造成雜質(zhì)的溶出和能耗的增大。因此，適宜的液料比為25∶1 (mL∶g)。

圖2 液料比對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.2 The effect of liquid-solid ratio on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率也逐步增大，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，得率達(dá)到最大2.388 9%，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，得率緩慢下降。由于過長(zhǎng)的提取時(shí)間可能導(dǎo)致綠原酸的結(jié)構(gòu)遭到破壞[21]以及雜質(zhì)的溶出。因此，適宜的提取時(shí)間為50 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.4 提取溫度對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率增加較為顯著，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大2.216 2%，繼續(xù)升高溫度，綠原酸得率又開始下降。這可能是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)了綠原酸的溶出，但是過高的溫度可能會(huì)破壞綠原酸的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致得率下降。因此，適宜的提取溫度為60 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.1.5 超聲功率對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響

從圖5可以看出，當(dāng)超聲功率較低時(shí)，杜仲葉茯磚茶綠原酸得率變化不大，當(dāng)功率超過80 W時(shí)，綠原酸得率顯著增加，當(dāng)功率為90 W時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大2.281 0%，繼續(xù)增大超聲功率，得率則開始下降。因此，適宜的超聲功率為90 W。

圖5 超聲功率對(duì)杜仲葉茯磚茶綠原酸得率的影響Fig.5 The effect of ultrasonic power on the chlorogenic acid extraction rate from eucommia ulmoides leaves of Fu brick tea

2.2 杜仲葉茯磚茶綠原酸提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)、提取溫度(D)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)4因素3水平共29組響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1，實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3，各響應(yīng)面分析圖見圖6。

由響應(yīng)面分析結(jié)果對(duì)各因素?cái)M合所得回歸方程為：Y=-5.308 62+0.055 567A+0.220 02B+6.075 40× 10-3C+0.128 40D+1.528 13×10-4AB-3.275 00×10-5AC-2.497 50×10-4AD-3.052 50×10-4BC+1.625 00×10-3BD+3.353 75×10-4×CD-5.494 51×10-4A2-6.252 81×10-3B2-1.754 75×10-4C2-1.452 65×10-3D2

表2 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 回歸方程方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression equation

注：***：差異極顯著(p<0.001)；**：差異高度顯著(p<0.01)；*：差異顯著(p<0.05)。

圖6 各因素交互作用對(duì)綠原酸得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effectsof various factors on chlorogenic acid extraction rate

由圖6可知，提取溫度，液料比以及乙醇濃度對(duì)綠原酸的得率均有較顯著的影響。其中，液料比對(duì)綠原酸得率的影響最為顯著，隨著液料比的增大，綠原酸得率先增大后減小，提取溫度對(duì)綠原酸得率影響相對(duì)顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)次之，提取時(shí)間影響最小，曲面較為平緩[21]。這與表3回歸分析結(jié)果相符。

經(jīng)模型預(yù)測(cè)，杜仲葉茯磚茶綠原酸最佳提取條件為超聲功率90 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)38.77%，提取時(shí)間49.96 min，液料比24.70∶1 (mL∶g)，提取溫度60.45 ℃，在該最佳條件下，杜仲葉茯磚茶多糖得率為2.518 7%?？紤]到實(shí)際操作過程的簡(jiǎn)便，對(duì)各個(gè)工藝參數(shù)稍作修改為：超聲功率90 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)39%，提取時(shí)間50 min，液料比25∶1 (mL∶g)，提取溫度60 ℃，經(jīng)過3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下，綠原酸得率為2.446 1%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為2.88%，說明該提取工藝條件準(zhǔn)確可行，具有應(yīng)用價(jià)值。

2.3 杜仲葉茯磚茶綠原酸體外降血糖抗氧化活性

2.3.1 體外降血糖作用研究

2.3.1.1 對(duì)α-胰淀粉酶的抑制活性

由圖7可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-胰淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用，但抑制能力較阿卡波糖要低。隨著綠原酸濃度的增大，抑制率也逐步增加，當(dāng)綠原酸濃度達(dá)到1.4 mg/mL時(shí)，其對(duì)α-胰淀粉酶的抑制率達(dá)到83.26%，相同濃度下阿卡波糖對(duì)α-胰淀粉酶的抑制率為97.14%。在0.4～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，綠原酸質(zhì)量濃度與抑制率間存在線性正相關(guān)，擬合方程為：Y=0.487 4X+0.162 1，R2=0.994 8，線性關(guān)系良好。通過該擬合方程可計(jì)算出杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-胰淀粉酶半抑制濃度(IC50)為0.69 mg/mL。

圖7 杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-胰淀粉酶抑制活性Fig.7 α-pancreatic amylase inhibitory activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

2.3.1.2 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖8可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用，但抑制能力較阿卡波糖要低。隨著綠原酸質(zhì)量濃度的增大，抑制率也逐步增加，當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度達(dá)到0.18 mg/mL時(shí)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到96.80%，與相同濃度下阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率相當(dāng)。從圖8還可以發(fā)現(xiàn)杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為0.08～0.10 mg/mL。

圖8 不同質(zhì)量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.8 α-glucosidase inhibitory activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

2.3.2 體外抗氧化活性研究

2.3.2.1 DPPH自由基清除作用

從圖9可以看出，杜仲葉茯磚茶綠原酸具有較好的DPPH自由基清除作用，其清除能力優(yōu)于Vc，其對(duì)DPPH自由基的清除效果隨質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)綠原酸濃度達(dá)12 μg/ mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率為91.84%，繼續(xù)增大綠原酸質(zhì)量濃度，清除率增加緩慢。當(dāng)綠原酸質(zhì)量濃度達(dá)24 μg/ mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)97.94%。

圖9 不同質(zhì)量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.9 Scavenging activity of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations against DPPH free radicals

2.3.2.2 還原力測(cè)定

由圖10可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.16 mg/mL時(shí)，杜仲葉茯磚茶綠原酸的還原力隨著質(zhì)量濃度的增大而顯著增大，當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.16 mg/mL時(shí)，其還原力增加稍有變緩。此外，由圖10可以看出，綠原酸的還原力明顯優(yōu)于Vc。

圖10 不同質(zhì)量濃度杜仲葉茯磚茶綠原酸還原力Fig.10 Ferric reducing power of chlorogenic acid from eucommia ulmoides leaves of fu brick tea at various concentrations

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所用杜仲葉茯磚茶以杜仲葉茶為原料，采用茯磚茶加工工藝制作而成，具有普通茯磚茶金花普茂，菌香濃郁，開湯后湯色紅濃，滋味醇和，香氣純正等特征，品質(zhì)較杜仲葉茶大大提高。綠原酸是杜仲葉重要活性成分之一，杜仲葉茯磚茶綠原酸的提取工藝研究結(jié)果表明，最佳提取條件為：超聲功率90 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)39%，提取時(shí)間50 min，液料比25∶1 (mL∶g)，提取溫度60 ℃，該條件下綠原酸得率為2.446 1%。降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲葉茯磚茶綠原酸對(duì)α-胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性均有一定的抑制作用，因此，經(jīng)常飲用杜仲葉茯磚茶可以起到降低餐后血糖和糖化血紅蛋白水平、減低血糖值波動(dòng)、防治糖尿病有關(guān)并發(fā)癥的作用。此外，杜仲葉茯磚茶綠原酸還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其對(duì)DPPH自由基的清除作用以及鐵還原力均高于Vc。