靳苗苗，李云云，張洪翠，張敏

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶,400715)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)因其營養(yǎng)豐富、具備一定藥用價值且栽培成本低，總產(chǎn)量居世界食用菌之最[1]；據(jù)統(tǒng)計，中國2013年雙孢蘑菇產(chǎn)量高達237萬t，產(chǎn)量居全球榜首[2]。然而，雙孢蘑菇呼吸作用極強、生理代謝旺盛，表面無角質(zhì)層保護、含水量高，極易產(chǎn)生褐變、受到微生物侵染[3]，常溫下貨架期僅1～3 d[4]。白度是雙孢蘑菇最直觀的品質(zhì)表征，直接影響雙孢蘑菇的適銷性[5]。影響雙孢蘑菇白度的因素有酶促褐變和非酶促褐變，其中酶促褐變是引起雙孢蘑菇褐變的主要原因，是酚類底物在多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)的催化下氧化生成醌類物質(zhì)，醌經(jīng)自發(fā)聚合后，通過與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基側(cè)鏈基團反應(yīng)產(chǎn)生黑色或褐色物質(zhì)而引起褐變[6]；非酶促褐變中主要是羰氨反應(yīng)(美拉德反應(yīng))[7]。乙醇是植物天然產(chǎn)生的次生代謝物質(zhì)之一，徐莉等[8]研究表明，乙醇熏蒸處理鮮切菊芋能顯著抑制PPO、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalamine ammonia-lyase，PAL)三種酶的活性，有效抑制了鮮切菊芋的褐變。YAN等[9]用200 mL/L乙醇處理鮮切萵苣，結(jié)果表明乙醇通過抑制PAL基因的表達影響PAL活性，進而抑制鮮切萵苣褐變。前期研究表明濃度為400 μL/L(乙醇溶液體積與泡沫箱體積比)的乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇有較好的保鮮效果，本文旨在研究400 μL/L乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇的護色作用，為探索雙孢蘑菇安全高效的護色方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙孢蘑菇，購于北碚天生農(nóng)貿(mào)市場。要求同批采收，無病蟲害和機械損傷，菇體成熟度、大小、形狀、顏色均勻一致，采后8 h內(nèi)運送至實驗室。

L-苯丙氨酸、無水對氨基苯磺酸、α-萘胺、鹽酸羥胺，成都市科龍化工試劑廠；愈創(chuàng)木酚，重慶北碚化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Pac Check?Model 650EC頂空分析儀，美國MOCON公司；HWS低溫恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；H1650R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀公司；UV-2450PC紫外可見分光光度計，日本島津公司；UltraScan?PRO測色儀，美國HunterLab公司。

1.3 樣品處理

挑選大小一致，無開傘，無病害，無機械損傷的雙孢蘑菇進行處理。將雙孢蘑菇隨機分為2組，每組雙孢蘑菇800 g左右，放入泡沫箱內(nèi)，同時放入展開的4層紗布(遠離雙孢蘑菇)，分別取一定量的乙醇(95%)均勻滴在紗布上，立即密封，室溫(25℃)熏蒸處理3 h。試驗中乙醇熏蒸濃度分別為0(CK)、400 μL/L(乙醇溶液體積與泡沫箱體積比)，處理結(jié)束后，將雙孢蘑菇通風30 min后放入(3±1)℃的冷藏柜預(yù)冷30 min，最后分裝到聚乙烯(polyethylene，PE)塑料袋(厚度為40 μm)內(nèi)封口，每袋(100±5)g，每組3個平行。將包裝后的雙孢蘑菇置于(3±1)℃的冷藏柜中貯藏12 d，每2 d測定1次指標。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 呼吸強度

呼吸強度采用靜置法經(jīng)頂空分析儀進行測定[10]。用頂空氣體分析儀檢測大氣中的CO2含量，記為ψ0，隨機選取雙孢蘑菇80 g，放入干燥皿中密封，25℃下靜置30 min，檢測干燥皿中CO2含量，記為ψ1。呼吸強度以每小時每千克雙孢蘑菇在呼吸代謝過程中釋放的CO2的質(zhì)量表示。按公式(1)計算：

(1)

式中：ψ0，大氣中CO2體積分數(shù)，%；ψ1，干燥皿中CO2體積分數(shù)，%；V，干燥皿中密閉空間的體積，mL；m，雙孢蘑菇質(zhì)量，kg；t，測定時間，h；1.96，CO2的摩爾質(zhì)量/摩爾體積之比(=44/22.4；按標準狀況下計算)。

1.4.2 PPO活性

參考OMS-OLIU等[11]方法并略做修改。雙孢蘑菇去皮后，每組隨機取菌蓋上白色肉質(zhì)3 g，置于研缽中，加入3 mL提取緩沖液，在冰浴條件下研磨成漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液。往試管中加入4 mL 0.1 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液和1.0 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液和100 μL酶提取液。記反應(yīng)體系在波長420 nm處吸光度值，以每克果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個活性單位。

1.4.3 POD活性

參考MOERSCHBACHER等[12]方法并稍作修改。雙孢蘑菇去皮后，每組隨機取菌蓋上白色肉質(zhì)3 g、3 mL提取緩沖液，在冰浴下用研缽研磨成漿，于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液即為酶提取液。取一試管，加入3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液、0.5 mL酶提取液、200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液后開始計時。在470 nm處測吸光度值，以每克果蔬樣品每分鐘吸光度變化值增加0.01為1個過氧化物酶活性單位。

1.4.4 PAL活性

參考曹健康等[13]的方法。

1.4.5 總酚

參照ZHOU等[14]方法。

1.4.6 超氧陰離子產(chǎn)生速率

參考YAN等[15]方法。雙孢蘑菇去皮后，每組隨機取菌蓋上白色肉質(zhì)3 g、3 mL提取緩沖液(1 mmol/L EDTA、0.3%TritonX-100、2%PVP、50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液)，在冰浴條件下用研缽研磨成漿，于4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液即為酶提取液。取1 mL酶提取液，加入1 mL 50 mmol/L pH 7.8磷酸緩沖液和1 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺溶液，搖勻并在25℃保溫20 min。取出后加入1 mL 17 mmol/L 對氨基苯磺酸溶液和1 mL 7 mmol/L α-萘胺溶液，混勻后在25℃保溫20 min進行顯色反應(yīng)后在530 nm處測其吸光度值，以每分鐘每克雙孢蘑菇產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量作為其產(chǎn)生速率(μmol/(min·g))。

1.4.7 相對電導(dǎo)率

參考蔣冬花等[16]的方法。

1.4.8 還原糖

參考李合生[17]的方法。

1.4.9 游離氨基酸

采用茚三酮顯色法[18]進行測定。

1.4.10 白度值

參考JAWORSKA等[19]方法，采用UltraScan?PRO測色儀對雙孢蘑菇傘蓋的白度值進行測定。用L*表示，L*值越大，顏色越白。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，IBM SPSS Statistics 22進行統(tǒng)計分析和LSD法顯著性差異檢驗，顯著性水平為0.05，通過Origin 8.6制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇呼吸強度的影響

由于菇體采收后無法再從栽培介質(zhì)中獲取養(yǎng)分，其往后生理代謝所需的能量必須由本身貯存的物質(zhì)所供應(yīng)[20]。呼吸強度是影響雙孢蘑菇耐貯性的重要因素，呼吸強度越大，雙孢蘑菇生理老化和衰老進程越快，褐變越嚴重[21-22]。如圖1所示，貯藏期間2組雙孢蘑菇的呼吸強度呈先上升后下降的趨勢，均在貯藏第2天達到呼吸高峰，處理組極顯著地降低了呼吸峰值(p<0.01)，并在整個貯藏期間與對照組差異顯著(p<0.05)。由此可見，400 μL/L乙醇熏蒸處理能顯著抑制貯藏期間雙孢蘑菇的呼吸強度，可能是因為乙醇抑制了乙烯合成相關(guān)酶[1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO)]的活性，從而抑制乙烯誘導(dǎo)的呼吸作用[23]。另有研究表明乙醇處理可以抑制香蕉[24]、西蘭花[25]、草莓[26]、桃[27]的呼吸強度。

圖1 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇呼吸強度的影響Fig.1 Effects of ethanol fumigation on respiration rate of Agaricus bisporus

2.2 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇PPO活性的影響

PPO是由核編碼的含銅金屬酶，是雙孢蘑菇體內(nèi)的褐變關(guān)鍵酶[28]。在有氧條件下，PPO能催化單酚通過羥基化作用形成相應(yīng)的O-聯(lián)苯酚，O-聯(lián)苯酚進一步氧化成O-苯醌，醌具有很強的親電子性，會聚合成褐色或黑色色素[29]。如圖2所示，在整個貯藏過程中PPO活性呈上升趨勢。在0～2 d PPO活性上升急促，可能是由于剛采摘的雙孢蘑菇切掉根部時，機體做出相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，使PPO活性增強[30]。乙醇處理組與對照組在貯藏4～8 d有顯著差異(p<0.05)，在10～12 d差異極顯著(p<0.01)，12 d時，乙醇處理組PPO活性比對照組低27.6%?？梢?，乙醇熏蒸處理能有效抑制雙孢蘑菇PPO活性，有研究發(fā)現(xiàn)25%乙醇溶液能通過競爭與PPO酶活中心基團結(jié)合抑制PPO酶活性[31-32]，此外，乙醇熏蒸處理在桃果實[33]、油豆角[34]上的應(yīng)用也得到相似結(jié)論。

圖2 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇PPO活性的影響Fig.2 Effects of ethanol fumigation on the polyphenol oxidase activity of Agaricus bisporus

2.3 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇POD活性的影響

POD是果蔬體內(nèi)一種重要的氧化還原酶，參與多種生理過程，POD在H2O2存在的條件下，使酚類物質(zhì)氧化生成醌類，導(dǎo)致組織褐變[35]。如圖3所示，在整個貯藏期間雙孢蘑菇POD活性呈波動上升。貯藏第2天，兩組POD活性急促上升，可能是因為采后切根脅迫刺激增強了雙孢蘑菇抗氧化系統(tǒng)。2～6 d乙醇處理組POD活性呈下降趨勢，與對照組存在顯著差異(p<0.05)。6～8 d兩組POD活性都呈上升趨勢，可能是由于超氧陰離子產(chǎn)生速率增加使POD反應(yīng)的關(guān)鍵底物H2O2含量增加，從而誘導(dǎo)POD活性增大[36]。第12天，相對于對照組，乙醇處理組將POD活性降低了33.19%，兩組之間存在極顯著差異(p<0.01)。與XU等[37]研究發(fā)現(xiàn)500 μL/L乙醇熏蒸處理能抑制西蘭花POD活性的結(jié)果一致。

圖3 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇POD活性的影響Fig.3 Effects of ethanol fumigation on the peroxidase activity of Agaricus bisporus

2.4 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇PAL活性的影響

PAL是催化酚類合成的關(guān)鍵酶，它能催化L-苯丙氨酸去氨基作用生成反式肉桂酸，并在此過程中產(chǎn)生酚類物質(zhì)[38]。如圖4所示，在0～2 d，PAL活性呈急速上升趨勢，可能是由于雙孢蘑菇貯藏前切根處理的外界脅迫，導(dǎo)致PAL活性的快速上升[39]。2 d后，乙醇熏蒸處理組能明顯抑制PAL活性，與對照組差異極顯著(p<0.01)，乙醇熏蒸處理組在整個貯藏期間都能有效地抑制雙孢蘑菇的PAL活性。YAN等[40]研究表明200 mL/L乙醇溶液處理能抑制鮮切萵苣PAL基因的表達，抑制酶促褐變底物酚類物質(zhì)的合成，從而抑制褐變。馮曉汀等[41]也得出乙醇處理鮮切西蘭花能明顯抑制其PAL活性的結(jié)論。

圖4 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇PAL活性的影響Fig.4 Effects of ethanol fumigation on the phenylalamine ammonia-lyase activity of Agaricus bisporus

2.5 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

通過呼吸作用進入生物體內(nèi)的氧分子，接受一個電子后，轉(zhuǎn)變?yōu)槌蹶庪x子等活性氧[42]，過多的活性氧會引起脂質(zhì)過氧化，使維持細胞區(qū)域化的膜系統(tǒng)受到瓦解或損傷，進而誘發(fā)或加重雙孢蘑菇褐變[43-44]。如圖5所示，在整個貯藏期間雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率呈先升高后下降的趨勢，0～4 d超氧陰離子產(chǎn)生速率持續(xù)增加，可能與0～4 d期間雙孢蘑菇呼吸強度較高導(dǎo)致氧氣進入菇體較多，超氧陰離子產(chǎn)生速率較高有關(guān)。后期超氧陰離子產(chǎn)生速率下降，可能與呼吸強度下降和抗氧化酶參與活性氧清除有關(guān)。第12 d，乙醇處理組的超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著低于對照組(p<0.05)?？傊?，乙醇熏蒸處理能有效抑制雙孢蘑菇貯藏期間內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)生速率。邸雅瓊等[45]研究表明，2 mL/kg乙醇熏蒸處理降低了枇杷果實中超氧陰離子產(chǎn)生速率。

圖5 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響Fig.5 Effects of ethanol fumigation on the superoxide radical production rate of Agaricus bisporus

2.6 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇總酚含量的影響

酚類物質(zhì)是酶促褐變的底物，雙孢蘑菇子實體中酚類物質(zhì)含量高，較高的酚含量賦予雙孢蘑菇較強的褐變潛力[46]。如圖6所示，在整個貯藏過程中總酚含量呈先增加后下降趨勢。0～2 d總酚含量增加，并且第2天達到峰值，可能是因為雙孢蘑菇貯藏前切根處理的外界脅迫，加快了苯基丙酸類合成途徑，促進酚類物質(zhì)的合成、積累[47]。2 d后，2組總酚含量都持續(xù)下降，一方面可能因為與酶類反應(yīng)結(jié)合，另一方面可能是作為氫供體參與自由基清除而消耗[48]。在2～12 d，乙醇熏蒸處理組總酚含量明顯低于對照組(p<0.05)?？梢?，400 μL/L乙醇熏蒸處理能降低雙孢蘑菇總酚含量，這與CHOI等[49]在鮮切生菜上的研究結(jié)果一致。

圖6 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇總酚含量的影響Fig.6 Effects of ethanol fumigation on total phenol content of Agaricus bisporus

2.7 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇相對電導(dǎo)率的影響

相對電導(dǎo)率即為溶液中溶質(zhì)的滲出率，從而間接表示細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，相對電導(dǎo)率越大，表示細胞膜破壞越嚴重[50]。如圖7所示，隨著貯藏時間的延長，相對電導(dǎo)率呈上升趨勢。貯藏2 d后，乙醇熏蒸處理組相對電導(dǎo)率顯著低于對照組(p<0.05)，到第12天，處理組相對電導(dǎo)率為22.72%，而對照組相對電導(dǎo)率已達到26.51%。整體來看，乙醇熏蒸處理能有效抑制雙孢蘑菇相對電導(dǎo)率的增加，這可能與乙醇能調(diào)整細胞膜結(jié)構(gòu)并維持其完整性有關(guān)[51]。另外賈慧慧等[52]研究發(fā)現(xiàn)，300 μL/L乙醇熏蒸處理能保持桃果實中較低的相對電導(dǎo)率和MDA含量，從而減輕逆境對膜系統(tǒng)的傷害。

圖7 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇相對電導(dǎo)率的影響Fig.7 Effects of ethanol fumigation on relative conductivity of Agaricus bisporus

2.8 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇還原糖含量的影響

還原糖中的羰基或羰基化合物與氨基化合物反應(yīng)，生成具有特殊香味的棕色甚至是黑色的大分子物質(zhì)類黑精或擬黑素，即為羰氨反應(yīng)[10]。羰氨褐變是非酶促褐變的重要途徑，還原糖作為羰氨反應(yīng)的直接反應(yīng)物，其含量的變化對非酶促褐變有較大影響[46]。如圖8所示，貯藏期間雙孢蘑菇還原糖含量呈先上升后下降趨勢。0～4 d還原糖含量呈上升趨勢，可能是因為前4 d呼吸強度較高，消耗分解了淀粉等很多大分子化合物，使還原糖含量上升，在2～4 d兩組差異顯著(p<0.05)。4 d后2組還原糖呈下降趨勢，到第12天時，處理組還原糖顯著低于對照(p<0.05)。可見，400 μL/L乙醇熏蒸處理能降低雙孢蘑菇還原糖含量。

圖8 乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇還原糖含量的影響Fig.8 Effects of ethanol fumigation on reducing sugar content of Agaricus bisporus

2.9 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇游離氨基酸含量的影響

雙孢蘑菇中蛋白質(zhì)降解生成的氨基酸，一部分參與蛋白質(zhì)的再次合成和自身分解消耗，另一部分以游離氨基酸的形式存在于蘑菇體內(nèi)，氧氣的供給使細胞膜透性增大，并將這些游離氨基酸氧化成醌等有色物質(zhì)，使子實體色澤變暗，組織松軟[53]。如圖9所示，在整個貯藏期間雙孢蘑菇游離氨基酸含量呈先上升后下降的趨勢。0～4 d游離氨基酸含量持續(xù)上升，可能是因為前4 d呼吸代謝旺盛使得蛋白質(zhì)水解快，導(dǎo)致游離氨基酸積累，處理組游離氨基酸含量明顯低于對照(p<0.05)。4 d后，2組游離氨基酸含量降低，對照組波動較大，可能是因為游離氨基酸與糖類發(fā)生羰氨反應(yīng)導(dǎo)致含量不穩(wěn)定。整體來看，在貯藏期間對照組游離氨基酸含量波動較大，而處理組變化相對平緩且含量處于較低水平，可知乙醇熏蒸處理能有效抑制蛋白質(zhì)水解，保持較低游離氨基酸含量。

圖9 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇游離氨基酸含量的影響Fig.9 Effects of ethanol fumigation on free amino acid content of Agaricus bisporus

2.10 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇白度的影響

白度值是雙孢蘑菇重要的評價指標。一般地，當L*>80時，雙孢蘑菇具有較好的品質(zhì)，零售商與消費者均可接受；當L*在69～79時，雖然仍具有較好的風味，但外觀上已不被消費者接受[54]。如圖10所示，隨著貯藏時間的延長，雙孢蘑菇白度值呈下降趨勢。2 d后，對照組白度值明顯低于處理組(p<0.05)，6 d后，2組之間存在極顯著差異(p<0.01)?？梢姡?00 μL/L乙醇熏蒸處理能有效延緩貯藏期間雙孢蘑菇白度值的下降。

圖10 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇白度的影響Fig.10 Effects of ethanol fumigation on the whiteness of Agaricus bisporus

3 結(jié)論

研究表明，400 μL/L乙醇熏蒸處理能有效抑制雙孢蘑菇PPO、POD、PAL活性并降低總酚的含量。同時，400 μL/L乙醇熏蒸處理能有效抑制雙孢蘑菇呼吸強度、超氧陰離子產(chǎn)生速率，維持細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。可見，乙醇熏蒸處理從抑制酶活、底物合成，維持細胞膜完整性三方面抑制雙孢蘑菇的酶促褐變。此外，400 μL/L乙醇熏蒸處理能有效降低雙孢蘑菇還原糖和游離氨基酸含量，從而抑制羰氨反應(yīng)引起的非酶促褐變。綜上所述，400 μL/L的乙醇熏蒸處理能抑制雙孢蘑菇酶促褐變、羰氨反應(yīng)的發(fā)生，進而延緩貯藏期間雙孢蘑菇白度值的下降，達到理想的護色效果。