方磊，李國(guó)明，徐珊珊，王憬，馬勇，蔡木易，谷瑞增，魯軍

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

免疫是人體的一種生理功能，人體依靠這種功能識(shí)別“自己”和“非己”成分，從而破壞和排斥進(jìn)入人體的抗原物質(zhì)。正常情況下，人體免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)異己抗原排異，抗感染，消除衰老、損傷的細(xì)胞；當(dāng)免疫系統(tǒng)失調(diào)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)低下，有時(shí)甚至反應(yīng)過(guò)激，引起變態(tài)反應(yīng)，造成機(jī)體對(duì)自身的傷害[1]，這種變態(tài)反應(yīng)就是過(guò)敏，主要由IgE介導(dǎo)[2]，其臨床癥狀主要有：腹瀉、蕁麻疹、發(fā)熱、嘔吐等等，嚴(yán)重情況下還可能造成虛脫和休克，甚至?xí)：ι{著易過(guò)敏人群的身體健康[3-4]。根據(jù)國(guó)外流行病學(xué)的調(diào)查資料顯示：全球大約有6%的兒童和3%～4%的成年人會(huì)對(duì)一種或者幾種食物過(guò)敏，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[5]，因此國(guó)內(nèi)外都在致力開發(fā)低過(guò)敏性或者具有抗過(guò)敏性的食品、保健食品和醫(yī)療藥品。

1999年國(guó)際食品法典委員會(huì)第23次會(huì)議上，公布了八大類主要過(guò)敏食物，分別為魚類、甲殼類、奶類、蛋類、花生、大豆、小麥、堅(jiān)果類，并認(rèn)為 90%以上的食物過(guò)敏反應(yīng)均是由以上八大類食物引起的，其中水產(chǎn)品就占2類，當(dāng)這些食物中的過(guò)敏蛋白與體內(nèi)的IgE相互結(jié)合后就會(huì)觸發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，因此，研究食物過(guò)敏的機(jī)理，通過(guò)部分或全部消除過(guò)敏原而降低食物過(guò)敏的發(fā)生率具有重要的社會(huì)意義。常見食物過(guò)敏原脫敏方法主要有加熱、酶解、輻射等。熱處理可以使過(guò)敏原的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其空間抗原表位發(fā)生改變或者破壞，從而在一定程度上降低或祛除致敏性。史曉霞等[6]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同溫度熱處理后的卵類粘蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)卷曲之間相互轉(zhuǎn)化導(dǎo)致其過(guò)敏原性變化；酶解會(huì)使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂，生成分子質(zhì)量更小的多肽或游離氨基酸，破壞過(guò)敏原表位原有的空間結(jié)構(gòu)，從而降低其過(guò)敏性。王麗娟等[7]利用木瓜蛋白酶水解凡納濱對(duì)蝦蝦肉及蝦蛋白，發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物致敏性明顯降低，但未能完全消除。食源性低聚肽是以動(dòng)植物食物蛋白為材料，經(jīng)過(guò)酶解、分離純化、噴霧干燥得到的低聚肽混合物。低聚肽的分子質(zhì)量大部分在1 000 u以下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，主要以二肽或三肽為主，比游離的氨基酸更容易被人體吸收，具有促消化吸收、降膽固醇、抗氧化等一系列的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與生理功能[8]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子質(zhì)量的低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶的活性具有一定的抑制作用，從而起到抗過(guò)敏的作用，可以改善易過(guò)敏人群的飲食條件[9]。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽都是通過(guò)酶解蛋白制成的小分子質(zhì)量低聚肽，但是關(guān)于二者致敏性和抗過(guò)敏性的研究報(bào)道卻很少見，故本文采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和透明質(zhì)酸酶抑制法檢測(cè)牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的致敏性和抗過(guò)敏性，為低致敏和抗過(guò)敏食品和藥品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽、三文魚皮膠原肽、玉米肽、小麥肽分別來(lái)源于牡蠣肉、三文魚皮、玉米蛋白和小麥蛋白，中食海氏生物科技有限公司；牡蠣肽-1、牡蠣肽-2、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2四種寡肽，吉爾生化(上海有限公司)；2個(gè)牡蠣過(guò)敏血清編號(hào)1-2、2個(gè)三文魚過(guò)敏血清編號(hào)3-4和2個(gè)陰性血清，Plasmalab公司；透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸鈉，SIGMA公司；對(duì)-二甲氨基苯甲醛(P-DAB)，南京化學(xué)試劑股份有限公司；其余藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DU-20恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；L-8900日立全自動(dòng)氨基酸分析儀，天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，Dynex Spectra Mr；Vivaflow 50超濾器，賽多利斯公司；LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津公司；色譜柱，TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，日本TOSOH公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1低聚肽的純化

分別稱取10 g牡蠣肽、三文魚皮膠原肽溶解于100 mL蒸餾水中，用Vivaflow超濾器超濾去除低聚肽中的大分子組分，并將剩余組分冷凍干燥保存。

1.3.2低聚肽的氨基酸組成測(cè)定

參考GB/T 5009.124—2003[10]方法，采用L-8900日立全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定分子質(zhì)量的分布：按照林峰等[11]選取的色譜條件制作相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線，然后將牡蠣肽和三文魚皮膠原肽用流動(dòng)相配成1 mg/mL的溶液，經(jīng)聚四氟乙烯過(guò)濾膜(孔徑0.2 μm)過(guò)濾后，上樣進(jìn)行高效凝膠過(guò)濾，使用GPC軟件對(duì)色譜圖進(jìn)行分析。

1.3.4低聚肽的抗過(guò)敏活性檢測(cè)

0.25 mmol/L CaCl20.1 mL加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶溶液(50 mg透明質(zhì)酸酶溶于20 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液中，pH 4.01)37 ℃培養(yǎng)20 min；分別加入4種食源性低聚肽不同濃度的溶液，各加入0.5 mL，37 ℃保溫20 min；然后在加入0.6 mL透明質(zhì)酸鈉(0.6 mg/mL)37 ℃保溫20 min；加入0.4 mol/L NaOH 1 mL,迅速置于冰上冷卻15 min；加入0.2 mL硼酸，沸水水浴3 min，立即冰水冷卻5 min，加入P-DAB試劑3 mL，37 ℃保溫20 min，顯色，在585 nm下測(cè)定OD值[12]。

抗過(guò)敏活性計(jì)算：

(1)

式中：A,對(duì)照溶液(酶+緩沖液+底物)的OD值;B,對(duì)照空白(緩沖液+緩沖液+底物)的OD值;C,樣品(酶+樣+底物)的OD值;D,樣品空白對(duì)照(緩沖液+樣+底物)的OD值。

1.3.5低聚肽的致敏性檢測(cè)：

按照ABRAMOVITCH等的方法[13]進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，取96孔酶標(biāo)板，將低聚肽溶液用CBS包被液稀釋至5 μg/mL，每孔加100 μL至酶標(biāo)板中，4 ℃包被過(guò)夜，用300 μL PBS-T(含有0.05%的Tween 20)緩沖液洗滌5次，以下所有的洗滌方式都以相同的方式進(jìn)行；將抗原包被的96孔板在37℃下用300 μL PBS-T稀釋的5%脫脂奶粉封閉1 h，并洗滌；向該板中加入100 μL用1%脫脂奶粉稀釋的血清，然后在室溫下?lián)u動(dòng)(45 r/min)孵育3 h，然后洗滌；再向每孔中加入100 μL二抗，將平板在室溫下輕輕晃動(dòng)孵育1h，將平板用PBST洗滌5次，然后再用PBS洗滌3次；再向每孔中加入200 μL的TMB顯色液，室溫避光孵育30 min，然后加入50μL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)，隨后在酶標(biāo)儀上450 nm處讀出吸光值，所有ELISA重復(fù)3次。

1.3.6寡肽的抗過(guò)敏活性檢測(cè)

按照2.4的方法，對(duì)4個(gè)不同寡肽的抗過(guò)敏活性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7寡肽的致敏性檢測(cè)

按照2.5的方法，對(duì)4個(gè)不同寡肽的致敏性進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Origin 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用單因素方差分析，若t檢驗(yàn)，p<0.05，則證明數(shù)據(jù)差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚肽的氨基酸組成

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成和含量如表1所示，牡蠣肽中天冬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、亮氨酸、賴氨酸和精氨酸的含量較高，總含量為58.07%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；富含人體必需的7種氨基酸(不含色氨酸)和2種半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸)，含量分別為33.20%和8.92%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，兩者占氨基酸總和的42.12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；三文魚皮膠原肽中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量較高，總含量為65.18%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；富含人體必需的7種氨基酸(不含色氨酸)和兩種半必需氨基酸，含量分別為22.48%和10.82%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，兩者占氨基酸總和的33.30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；從整體氨基酸組成來(lái)看：牡蠣肽中含有較多的疏水性、酸性和堿性氨基酸，而三文魚皮膠原肽中親水性氨基酸較多；以上表明：2種食源性低聚肽含有多種氨基酸且含量豐富，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人體補(bǔ)充必需氨基酸的重要來(lái)源。

表1 牡蠣肽、三文魚皮膠原肽的氨基酸含量Table 1 The amino acid content of oyster peptides and Salmon skin collagen peptide

2.2 低聚肽的分子質(zhì)量分布

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質(zhì)量分布范圍通過(guò)高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定：2種低聚肽的凝膠色譜圖如圖1所示，用GPC分析軟件計(jì)算得到牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質(zhì)量分布范圍，結(jié)果如表2所示；牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質(zhì)量主要分布在1 000 u以下，其中牡蠣肽含量為88.54%、三文魚皮膠原肽含量為88.53%，分子質(zhì)量在10 000 u以上的蛋白含量很低，其中三文魚皮膠原肽的分子質(zhì)量在10 000 u以上的含量為零，有研究報(bào)道[14]：分子質(zhì)量較高的蛋白如人血清白蛋白或球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等大分子蛋白可以增強(qiáng)透明質(zhì)酸酶的活性。

圖1 牡蠣肽和三文魚皮膠原肽色譜圖(220nm)Fig.1 Oyster peptide and Sphinx skin peptide chromatogram (220nm)

由表2可以看出2種食源性低聚肽的分子質(zhì)量在140～500 u范圍內(nèi)的肽段含量最高，分別占比52.74%和50.71%，占據(jù)了1 000 u以下分子質(zhì)量的大部分，而分子質(zhì)量在該范圍內(nèi)主要是二肽和三肽。從蛋白質(zhì)和肽的吸收角度講，人體從胃腸部位吸收二肽或三肽是一種重要的生理現(xiàn)象，且多數(shù)氨基酸是以寡肽形式被吸收的[15]。MAEBUCHI等[16]研究表明：蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后形成的二肽和三肽可以不經(jīng)消化，能夠迅速被吸收，比游離氨基酸的吸收率提高2～2.5倍，具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能[17]。

表2 低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular weight distribution of oligopeptides

2.3 低聚肽的抗過(guò)敏活性

低聚肽的抗過(guò)敏活性通過(guò)透明質(zhì)酸酶抑制法來(lái)測(cè)定，并以2種植物食源性低聚肽(小麥肽和玉米肽)做對(duì)照，比較不同低聚肽的抗過(guò)敏活性。由圖2可知，4種低聚肽的抗過(guò)敏活性高低順序?yàn)椋耗迪犽?膠原肽>小麥肽>玉米肽，牡蠣肽的抗過(guò)敏活性最高，牡蠣肽的質(zhì)量濃度為60 mg/mL時(shí)可以抑制50%以上的透明質(zhì)酸酶的活性，相同質(zhì)量濃度的膠原肽和小麥肽分別可以抑制35%和33%以上的透明質(zhì)酸酶活性，玉米肽的抗過(guò)敏活性最低。

圖2 食源性低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制作用Fig.2 Food-borne oligopeptide on hyaluronidase inhibition

桂枝提取物可以有效抑制透明質(zhì)酸酶活性[18]，且抗過(guò)敏活性和抗氧化活性有很好的正相關(guān)性，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽具有較強(qiáng)的抗氧化作用[19-20]，0.529 mg/mL的牡蠣肽以及14.95 mg/mL的三文魚皮膠原肽就可以抑制50%的羥基自由基，故2種低聚肽的抗過(guò)敏活性較高?？惯^(guò)敏活性與低聚肽的分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)，分子質(zhì)量小于1 000 u的肽段對(duì)透明質(zhì)酸酶的抑制作用最大，抗過(guò)敏活性最強(qiáng)[9]。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的分子質(zhì)量分布試驗(yàn)表明，分子質(zhì)量小于1 000 u的肽段含量高達(dá)88.5%以上，能夠最大程度的抑制透明質(zhì)酸梅的活性，從而起到抗過(guò)敏的作用。

2.4 低聚肽抗過(guò)敏活性劑量效應(yīng)曲線

由圖3可以看出，4種低聚肽的抗過(guò)敏活性均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抗過(guò)敏活性隨著濃度的增加而提高。其中，牡蠣肽的抗過(guò)敏活性最強(qiáng)，玉米肽的抗過(guò)敏活性最弱。經(jīng)過(guò)計(jì)算，牡蠣肽、三文魚皮膠原肽、小麥肽和玉米肽的IC50值分別是51.57、79.37、89.57和107.01 mg/mL。

圖3 低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶抑制作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig.3 The dose-effect relationship of oligopeptide on hyaluronidase inhibition

雖然目前市場(chǎng)上有關(guān)抗過(guò)敏的藥物很多，主要分為化學(xué)藥物以及天然藥物，尤以化學(xué)藥物居多，但是化學(xué)藥物的作用很強(qiáng)，一般會(huì)引起副作用，會(huì)損害人體的健康。天然藥物是直接從天然植物中提取分離獲得的，抗過(guò)敏效果明顯，相對(duì)于化學(xué)藥物對(duì)人體的影響較小，但是由于天然藥物的成分比較復(fù)雜，目前的分離分析水平又不能完全分離這些復(fù)雜的化合物，給天然藥物的分離制備帶來(lái)很大的困難。與這些抗過(guò)敏藥物相比，牡蠣肽和膠原肽的抗過(guò)敏活性要低很多，但是這2種低聚肽是來(lái)自食物蛋白質(zhì)，成分明確，制備工藝比較成熟，具有較高的安全性，并且作用溫和，不會(huì)產(chǎn)生咳嗽 、皮疹、腎臟毒害，味覺(jué)失調(diào)等毒副作用，可長(zhǎng)期食用[21]。

2.5 低聚肽的低致敏性分析

采用ELISA法分析低聚肽的低致敏性，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 牡蠣肽對(duì)血清IgE反應(yīng)性Fig.4 Oyster peptide on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(牡蠣蛋白0.445，牡蠣肽0.323),與牡蠣蛋白相比，*表示p<0.05差異顯著。

圖5 三文魚皮膠原肽對(duì)血清IgE反應(yīng)性Fig.5 Trichosanthin collagen peptide on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(三文魚蛋白0.315，三文魚皮膠原肽0.181)，與三文魚皮蛋白相比，*表示p<0.05差異顯著。

牡蠣肽和三文魚皮膠原肽比相應(yīng)的蛋白質(zhì)具有較低的IgE反應(yīng)性。與牡蠣蛋白相比，牡蠣肽對(duì)每種血清的IgE反應(yīng)性顯著降低(p<0.05)，且與血清2反應(yīng)的OD450值要低于陰性血清的OD450值，幾乎沒(méi)有致敏性；三文魚皮膠原肽對(duì)每種血清的OD450值均高于陰性血清的OD450值，具有致敏作用，但是與三文魚蛋白相比其IgE反應(yīng)性也顯著降低(p<0.05)，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所以2種低聚肽的致敏作用很低。

致敏性的強(qiáng)弱與過(guò)敏原蛋白的氨基酸數(shù)目、組成、排列順序以及蛋白的分子構(gòu)型有關(guān)，酶解可使蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂，破壞過(guò)敏原蛋白原有的空間結(jié)構(gòu)，從而降低其過(guò)敏性。蔡木易等[22]發(fā)明了一種酶解制備低致敏性的高蛋白牡蠣活性肽的方法，經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定致敏性發(fā)現(xiàn)，牡蠣活性肽的抗原性較牡蠣蛋白降低了80%以上。SHIMALURA等[23]采用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和蛋白酶P對(duì)甲殼動(dòng)物蛋白進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)酶解后蛋白質(zhì)的過(guò)敏性幾乎完全消失。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽都是經(jīng)過(guò)酶解蛋白制成的小分子多肽，可能破壞過(guò)敏蛋白原有的空間結(jié)構(gòu)，故2種動(dòng)物源性低聚肽的致敏性較低，是開發(fā)低致敏性功能食品的重要來(lái)源，可以作為新的功能營(yíng)養(yǎng)成分應(yīng)用于食品，保健食品和藥品的開發(fā)與生產(chǎn)。

2.6 寡肽的序列及純度分析

寡肽的合成由吉爾生化(上海)有限公司完成，序列見表3；并利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)合成的寡肽純度進(jìn)行分析，以牡蠣肽-1為例，結(jié)果見圖6，由圖6中可以看出，合成的牡蠣肽-1純度達(dá)到99.12%，牡蠣肽-2、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2的寡肽純度分別為98.13%、98.68%和98.52%。

表3 寡肽的序列及純度Table 3 Sequence and purity of the oligopeptides

圖6 牡蠣肽-1寡肽的HPLC分析Fig.6 HPLC result of Oyster peptide-1

2.7 寡肽的抗過(guò)敏活性

4種寡肽的抗過(guò)敏活性結(jié)果見圖7，從圖7中可以看出，4種寡肽的抗過(guò)敏活性高低順序?yàn)椋耗迪犽?1>三文魚皮膠原肽-1>牡蠣肽-2>三文魚皮膠原肽-2；4種寡肽的分子質(zhì)量大小在表3中可知，牡蠣肽-1<三文魚皮膠原肽-1<牡蠣肽-2<三文魚皮膠原肽-2，但4種寡肽的抗過(guò)敏活性依次降低，故抗過(guò)敏活性與低聚肽的分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)；從氨基酸的組成可知，牡蠣肽-1、三文魚皮膠原肽-1、三文魚皮膠原肽-2中含有纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸，均為疏水性氨基酸占比較高，說(shuō)明寡肽的抗過(guò)敏活性與疏水性氨基酸有一定的正相關(guān)性；整體來(lái)看，牡蠣寡肽的抗過(guò)敏活性高于三文魚皮膠原寡肽，與上述3.3中的牡蠣肽抗過(guò)敏活性高于膠原肽抗過(guò)敏活性的結(jié)果一致。MARIA等[24]合成了一種三肽RTY并發(fā)現(xiàn)該三肽可有效地抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及大鼠嗜堿性粒細(xì)胞β-己糖胺酶的釋放，降低過(guò)敏反應(yīng)，表明食源性寡肽確實(shí)具有一定的抗過(guò)敏活性。

圖7 不同寡肽的透明質(zhì)酸酶抑制作用Fig.7 Different oligopeptides on hyaluronidase inhibition注：與牡蠣肽-1相比，*表示p<0.05，差異顯著。

22.8 寡肽的低致敏性分析

牡蠣寡肽和三文魚皮膠原寡肽的低致敏性結(jié)果如圖8、圖9所示，與相應(yīng)的蛋白質(zhì)相比，4種寡肽的OD450值均顯著降低(p<0.05)；其中牡蠣肽-2對(duì)每種血清的OD450值均大于牡蠣肽-1，這是因?yàn)槟迪犽?2中含有較多的親水性氨基酸，而牡蠣肽-1中疏水性氨基酸較多，有文獻(xiàn)報(bào)道[25-26]，食物過(guò)敏蛋白的氨基酸序列大多為親水性氨基酸，與血清中的IgE容易結(jié)合從而導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生；因此牡蠣肽-2的致敏作用要高于牡蠣肽-1；三文魚皮膠原肽-1的OD450值小于三文魚皮膠原肽-2，且2種寡肽的氨基酸序列中均以疏水性氨基酸較多，但二者的分子質(zhì)量差異比較大，導(dǎo)致致敏作用不同；故食源性寡肽的致敏作用與氨基酸的組成和分子質(zhì)量有一定的相關(guān)性。

圖8 牡蠣寡肽對(duì)血清IgE反應(yīng)性Fig.8 Oyster oligopeptides on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(牡蠣蛋白0.445, 牡蠣肽-1 0.472, 牡蠣肽-2 0.515)與牡蠣蛋白相比，*表示p<0.05，差異顯著。

圖9 牡蠣寡肽對(duì)血清IgE反應(yīng)性Fig.9 Trichosanthin collagen oligopeptides on serum IgE reactivity注：虛線代表陰性血清的平均OD值(三文魚蛋白0.315, 三文魚皮膠原肽-1 0.175, 三文魚皮膠原肽-2 0.206)，與三文魚皮蛋白相比，*表示p<0.05，差異顯著。

3 結(jié)論

本研究對(duì)牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成和分子質(zhì)量分布測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗過(guò)敏活性和致敏作用也進(jìn)行了研究。牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的氨基酸組成豐富，富含人體必需氨基酸和半必需氨基酸(組氨酸和精氨酸)；2種低聚肽的分子質(zhì)量小于1 000 u的肽段含量高達(dá)88.5%以上，主要分布在140～500 u范圍內(nèi)，以二肽和三肽為主；牡蠣肽、三文魚皮膠原肽與小麥肽、玉米肽4種低聚肽對(duì)透明質(zhì)酸酶都有一定的抑制作用，IC50值分別為51.57、79.37、89.57、107.01 mg/mL，其中牡蠣肽的抗過(guò)敏作用最強(qiáng)，膠原肽次之，玉米肽的抗過(guò)敏作用最弱；與相應(yīng)的蛋白質(zhì)相比，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的致敏作用均顯著降低。然后選擇4種氨基酸組成和分子質(zhì)量差異比較大的寡肽進(jìn)一步研究其抗過(guò)敏活性和低致敏作用，發(fā)現(xiàn)牡蠣寡肽的抗過(guò)敏活性要高于三文魚皮膠原寡肽，且寡肽的抗過(guò)敏活性與分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)性，與疏水性氨基酸呈一定的正相關(guān)性，4種寡肽的致敏作用也顯著降低，且與氨基酸的組成和分子量有一定的相關(guān)性。目前，牡蠣肽和三文魚皮膠原肽的生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)基本成熟，且成分比較明確，對(duì)人體具有較高的安全性，為其作為低致敏和抗過(guò)敏成分應(yīng)用于食品、藥品的開發(fā)提供了一定的理論支持，但對(duì)于2種低聚肽的體內(nèi)抗過(guò)敏活性及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。