趙菡，周麗，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

枯草桿菌蛋白酶是絲氨酸蛋白酶的第二大家族，已經(jīng)作為模式酶被廣泛研究[1]，研究內(nèi)容主要包括改造其催化活性[2-3]、底物結(jié)合特異性[4]以及穩(wěn)定性[5]等。納豆激酶(Nattokinase，NK，EC3.4.21.62)是由日本傳統(tǒng)食品納豆在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種枯草桿菌蛋白酶，其編碼基因?yàn)閍prN[6]，具有保守的催化活性中心(Asp32, His64 和 Ser221)。納豆激酶不僅可以通過激活纖溶酶原將其轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶[7]，間接溶解纖維蛋白，還可以直接作用于交聯(lián)的纖維蛋白[8]，因而具有很強(qiáng)的溶栓功效。相較于市售的溶栓藥物(鏈激酶、尿激酶以及蛇毒纖溶酶等)，納豆激酶還有半衰期長、安全、副作用小以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此將其開發(fā)為治療心腦血管疾病的口服藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景[9]。然而野生型納豆激酶的酶活較低，熱穩(wěn)定性較差，尤其當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，酶分子會(huì)迅速失活，不利于其在工藝生產(chǎn)高溫環(huán)節(jié)保證酶活，因此不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)[10]。本文選用一種高效的方法以提高納豆激酶的活性以及熱穩(wěn)定性。

在蛋白質(zhì)中，翻譯后的脫酰胺過程將天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)轉(zhuǎn)化為帶負(fù)電的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，可能改變蛋白質(zhì)的電荷網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而影響酶的活性、最適pH值和穩(wěn)定性等[11]。因此，可通過替換酶分子中的Asn和Gln改造酶分子的性質(zhì)。如KATO將蛋清溶菌酶中2個(gè)Asn突變?yōu)锳sp后，最適pH值向酸性偏移了0.5個(gè)單位[12]；JAKOB通過改造蛋白酶BgAP表面的Asn和Gln，使其在pH值8.5下的熱穩(wěn)定性提高了2.5 ℃[13]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)表面氨基酸的改造可以改變酶的性質(zhì)。例如，KHURANA將表面的疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸提高了脂肪酶的穩(wěn)定性[14]MICHAEL通過替換酶分子表面的76位和218位氨基酸提高了枯草蛋白酶BPN’的穩(wěn)定性[15]。此外，表面電荷的改造也可提高酶的活性[16]和穩(wěn)定性等。如，JAOUADI通過優(yōu)化絲氨酸蛋白酶表面電荷與電荷之間的相互作用提高了其熱穩(wěn)定性[17]。然而，許多研究集中于改造酶活性中心附近的氨基酸，而遠(yuǎn)離活性中心的位點(diǎn)也可能影響酶的性質(zhì)，如，MIYAZAKI采用定向進(jìn)化方法篩選得到熱穩(wěn)定性及酶活提高的突變體位于遠(yuǎn)離酶活性中心的loop環(huán)上[18]。

綜合以上研究，為了高效選擇突變位點(diǎn)，設(shè)定以下選點(diǎn)原則：選擇表面的Asn和Gln；為非保守殘基；遠(yuǎn)離酶的活性中心。最終選擇8個(gè)位點(diǎn)，分別將其突變?yōu)閹ж?fù)電的Asp和Glu，通過篩選得到酶活和熱穩(wěn)定性提高的突變株，為納豆激酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株，質(zhì)粒以及培養(yǎng)條件

EscherichiacoliJM109以及E.coliBL21 (DE3)分別用于質(zhì)粒構(gòu)建以及蛋白表達(dá)，由作者實(shí)驗(yàn)室保藏。質(zhì)粒pET-24a用作表達(dá)載體，將納豆激酶的成熟肽與前導(dǎo)肽基因序列克隆至pET-24a載體上(于限制性酶切位點(diǎn)XbaI 和BamHI之間)，得到重組表達(dá)載體pET-24a-pro-NK(實(shí)驗(yàn)室已有)[10]。LB培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl)用于質(zhì)粒的構(gòu)建與培養(yǎng)。自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052用于納豆激酶的發(fā)酵表達(dá)[19]。培養(yǎng)基中卡那霉素的終質(zhì)量濃度為50 μg/ mL。

1.2 主要材料與儀器

1 mL離心式蛋白純化空柱、含鎳樹脂：生工生物工程(上海)股份有限公司；對硝基苯胺(pNA)、四肽合成底物(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-nitroanilide，suc-AAPF-pNA) ：Sigma公司；PCR儀：BIO-RAD公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)有限公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；多功能酶標(biāo)儀：Bioteck公司(美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因操作

以質(zhì)粒pET-24a-pro-NK為模板采用定點(diǎn)突變(重疊延伸)方法構(gòu)建突變體。所有突變體相關(guān)引物如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in this study

PCR得到的基因產(chǎn)物于DpnI酶中37℃消化5 h以降解模板，然后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中并提取質(zhì)粒，基因序列驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化至E.coliBL 21(DE3)中，成功獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.2 目的蛋白的表達(dá)純化

挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種于含卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。以2%的接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至100 mL自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM-5052中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600值達(dá)到2左右時(shí)，溫度降至18 ℃，培養(yǎng)20 h，離心收集菌體，用10 mL結(jié)合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)重懸菌體，并于冰上超聲破碎，收集破碎上清液，于4 ℃經(jīng)親和層析鎳柱離心柱(將含鎳樹脂裝入1 mL離心空柱中)純化目的蛋白，采用含50～100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，純酶液于100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液中過夜透析。采用Bradford法測定蛋白濃度，并將野生型以及突變體純酶液調(diào)節(jié)至相同的蛋白濃度。

1.3.3 酶活的測定[3]

在100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液(含0.1 mmol/L CaCl2)中，以人工合成的suc-AAPF-pNA為底物，以對硝基苯胺(pNA)為標(biāo)準(zhǔn)，在終體積為0.2 mL，25 ℃下反應(yīng)3 min，根據(jù)405 nm 的吸收值測定生成pNA濃度。一個(gè)酶活力單位定義為：在25 ℃，pH值8.0，底物濃度為0.4 mmol/L時(shí)，1 min內(nèi)，將1 μmol suc-AAPF-pNA轉(zhuǎn)化為1 μmolpNA所需的酶量。

1.3.4 最適溫度和最適pH值的測定

取適量純酶液溶解于100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中，根據(jù)以上酶活測定方法在30、40、50、60、70 ℃下測定其活性，將最高的酶活力定義為100%。在不同pH值緩沖液條件下測定野生型酶和突變體酶的活性，將最高的酶活力定義為100%，pH值3.0～5.0采用50 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH值6.0～8.0為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值9.0～11.0為50 mmol/L碳酸鈉緩沖液(至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。

1.3.5 熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性的測定

取適量野生型和突變體純酶液于55 ℃中分別孵育(10～60 min)，測定各個(gè)純酶液的半衰期(t1/2)，將未處理的原始酶活定義為100%，并以相對酶活對時(shí)間作圖。取適量野生型和突變體純酶液在4 ℃下，不同的緩沖液(pH 3.0～5.0，50 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 6.0～8.0，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 9.0～11.0，50 mmol/L碳酸鈉緩沖液)中孵育4 h，測定剩余酶活，將最高的酶活力定義為100%，并以相對酶活對pH值作圖(至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值)。

1.3.6 動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定

以人工合成的四肽suc-AAPF-pNA為底物，底物濃度范圍為0.05～1 mmol/L，在終體積為0.2 mL，25 ℃下反應(yīng)3 min，測量suc-AAPF-pNA的初始反應(yīng)速率，通過軟件GraphPad Prism 5擬合得到Km與Vmax值，根據(jù)kcat=Vmax/ [Enzyme]，最后求得kcat及催化效率常數(shù)kcat/Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變點(diǎn)的選擇

為提高納豆激酶的活性及穩(wěn)定性，本文依照以下3個(gè)原則選擇突變點(diǎn)：利用GETAREA軟件篩選表面暴露程度>50%的Asn和Gln；位點(diǎn)遠(yuǎn)離酶的活性中心(以減少對酶活的負(fù)面影響)；為非保守氨基酸(圖1)。最終，構(gòu)建了8個(gè)突變體N43D、Q59E、Q103E、N109D、 N118D、Q185E、Q206E、N218D(圖2)。

箭頭所指為突變位點(diǎn)圖1 NK與其他枯草桿菌蛋白酶的序列比對Fig.1 Sequence alignment of NK with other subtilisins

圖b由圖a旋轉(zhuǎn)一定角度得到；D32,H64,S221為催化活性中心位點(diǎn)圖2 突變位點(diǎn)在納豆激酶三維結(jié)構(gòu)中的分布Fig.2 The distribution of mutants in NK three-dimensional structure

2.2 單點(diǎn)突變的初步篩選

為初步篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體，取野生型與突變體粗酶液于65 ℃處理30 min，測定剩余酶活，如圖3-a所示，N218D的熱穩(wěn)定性有所提高，相較于WT其殘余酶活提高了15%左右。經(jīng)過初篩，Q59E酶活顯著高于WT(圖3-b)。

a-熱穩(wěn)定性篩選；b-酶活篩選圖3 單突變體初步篩選Fig.3 Preliminary screening of single mutants

2.3 組合突變與酶學(xué)性質(zhì)表征

為進(jìn)一步提高納豆激酶的綜合性質(zhì)，將初步篩選得到的酶活提高突變體Q59E以及熱穩(wěn)定性提高的突變體N218D進(jìn)行組合，得到雙突變體Q59E-N218D。

為了準(zhǔn)確表征各個(gè)突變體酶，將WT以及3個(gè)突變體(Q59E、N218D和Q59E-N218D)進(jìn)行表達(dá)純化，取純酶液測定其酶學(xué)性質(zhì)。如圖4-a和圖4-b，各個(gè)突變體酶的最適溫度和最適pH值并未發(fā)生偏移。如圖5-a，突變體Q59E的熱穩(wěn)定性較差，而突變體N218D和Q59E-N218D的熱穩(wěn)定性明顯提高。其中，N218D在55 ℃下的t1/2約為28 min(表2)，相較于WT(約12 min)提高了1.3倍。組合突變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，其t1/2提高至33 min左右，為WT的2.75倍。通過對比野生型和突變體的pH值穩(wěn)定性(圖5-b)，發(fā)現(xiàn)Q59E和N218D的堿性穩(wěn)定性較差，然而雙突變Q59E-N218D 在pH 5～7更為穩(wěn)定，即耐酸性較WT有所提高。

a-最適溫度曲線；b-最適pH曲線圖4 最適反應(yīng)條件的測定Fig.4 Determination of the optimum reaction conditions

2.4 動(dòng)力學(xué)常數(shù)和比酶活的測定

為了研究催化活性，本文測定了突變體酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)以及比酶活值(如表3)。突變體N218D 熱穩(wěn)定性提高，可能是由于其結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，然而代價(jià)是與底物的親和能力下降以及kcat的降低，導(dǎo)致催化效率較WT下降了約40%。相反，突變體Q59EKm值降低，說明與底物的親和能力增強(qiáng)，同時(shí)kcat提高了37%，因而催化效率顯著提高，約為WT的1.60倍。另外，Q59E的比酶活提高，為WT的1.54倍，與動(dòng)力學(xué)參數(shù)相一致。然而，Q59E熱穩(wěn)定性較差，說明酶活與熱穩(wěn)定性之間存在一定的平衡，酶的催化活性更需要柔性的空間構(gòu)象，而酶的熱穩(wěn)定性則要求酶結(jié)構(gòu)的剛性以抵御外界壓力的破壞。因此將Q59E引入N218D，雙突變體Q59E-N218D催化效率比單突變體N218D增強(qiáng)，同時(shí)熱穩(wěn)定性明顯提高，與何孝天的研究相比[10](其提高納豆激酶熱穩(wěn)定性的同時(shí)伴隨著催化活性的大幅度下降)，本研究提供了綜合性質(zhì)更好的突變株，為納豆激酶的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。所以組合突變可以一定程度上綜合單點(diǎn)突變的優(yōu)勢獲得最佳平衡，從而得到更為有效的突變酶。

a-原始酶與突變體的熱穩(wěn)定性(在55℃下殘余酶活隨時(shí)間變化)曲線；b-原始酶與突變體在不同pH下的穩(wěn)定性曲線圖5 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的測定Fig.5 Determination of the thermal stability and pH stability

表2 野生型與突變體酶的半衰期值Table 2 Half-life of wild-type NK and mutants

酶半衰期(t1/2)/minwild-type11.90±0.59Q59E4.81±0.14N218D28.17±0.35Q59E-N218D32.38±0.98

表3 野生型酶與突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及比酶活Table 3 Kinetic parameters and specific activities of wild-type NK and mutants

3 討論

本文通過定點(diǎn)突變構(gòu)建重組納豆激酶突變體，經(jīng)過篩選得到催化活性顯著提高的突變體Q59E以及熱穩(wěn)定性提高突變體N218D。組合突變Q59E-N218D的熱穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，由野生型酶的12 min提高至33 min，且其比酶活達(dá)到與原始酶相似水平。

本文酶活提高突變體Q59E，在蛋白質(zhì)表面引入了負(fù)電荷，可能通過遠(yuǎn)距離靜電相互作用影響酶活性中心區(qū)域的結(jié)構(gòu)，從而提高了納豆激酶的催化活性。因此，本文采用篩選突變體的方法可作為一種改善酶性質(zhì)的有效策略，為其他酶的改造提供參考。