吳麗珺

(河南財政金融學(xué)院 體育系，河南 鄭州 450046)

0 引言

疲勞是指“機(jī)體的生理過程不能持續(xù)其機(jī)能在一特定水平或不能維持預(yù)定的運(yùn)動強(qiáng)度”[1].疲勞有多種表現(xiàn)形式，其中力竭是疲勞的一種特殊表現(xiàn)形式，機(jī)體在疲勞狀態(tài)下繼續(xù)從事運(yùn)動，直到肌肉或器官不能維持運(yùn)動，即為力竭狀態(tài).自哈佛大學(xué)疲勞研究所開始重視疲勞問題的相關(guān)研究以來，疲勞的發(fā)生機(jī)制就一直是科學(xué)界研究的熱點(diǎn)問題.一百多年以來，學(xué)者們從不同的角度對疲勞機(jī)制進(jìn)行了研究.包括衰竭學(xué)說、堵塞學(xué)說、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定失調(diào)學(xué)說、保護(hù)性抑制學(xué)說、突變理論與自由基損傷學(xué)說等理論[1]的出現(xiàn)，豐富了疲勞發(fā)生機(jī)制的研究體系，但仍難以解釋疲勞發(fā)生過程中的一些問題，如免疫機(jī)能的改變.因此，基于“J形曲線理論”[2]、“開窗理論”[3]、“免疫抑制因子調(diào)節(jié)學(xué)說”[4]等研究成果的基礎(chǔ)上，有學(xué)者將“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)”理論[5]引入到疲勞學(xué)說的研究當(dāng)中.

隨著研究的進(jìn)一步深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，免疫機(jī)能如細(xì)胞免疫或體液免疫水平的降低并不是身體機(jī)能下降的主要因素，而免疫平衡的改變?nèi)?型T細(xì)胞(T cell-1, T1)/2型T細(xì)胞(T cell-2, T2)失衡才是抑制身體機(jī)能的主要誘因.T1/T2平衡主要用于判斷機(jī)體細(xì)胞免疫與體液免疫之間的平衡狀態(tài)，T1、T2型細(xì)胞因子分泌的改變是T1/T2平衡常用的評價依據(jù).γ-干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4, IL-4)是T1、T2細(xì)胞分泌的最典型的細(xì)胞因子[6, 7]，兩者分泌水平的變化都會導(dǎo)致T1/T2失衡，從而影響身體機(jī)能.然而，在疲勞發(fā)生過程中，導(dǎo)致T1/T2失衡的機(jī)制目前還不清楚.研究發(fā)現(xiàn)，抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell, APC)所產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)、白細(xì)胞介素-27(Interleukin-27, IL-27)是介導(dǎo)IFN-γ分泌、啟動T1型免疫反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[8-11].那么，疲勞發(fā)生過程中T1/T2平衡的變化是否與IL-12、IL-27分泌的改變有關(guān)，仍需實驗進(jìn)行證實.因此，本研究擬采用力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練的方式建立大鼠疲勞模型，通過觀察疲勞大鼠T1/T2平衡的變化及其與IL-12、IL-27的關(guān)系，探討疲勞大鼠T1/T2失衡的可能機(jī)制.

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

20只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量341±27 g，8周齡.飼養(yǎng)按照要求進(jìn)行，飼養(yǎng)環(huán)境溫度18 ℃～25 ℃，相對濕度40%～60%，自然光照，自由飲食和飲水.大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后進(jìn)行分組，隨機(jī)分成正常對照組(A組，n=10)與疲勞模型組(B組，n=10)兩組，分組后兩組大鼠體質(zhì)量無顯著差異.

1.2 疲勞模型的建立

借助力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練的方式，采用文獻(xiàn)[12]的大鼠游泳力竭標(biāo)準(zhǔn)(大鼠協(xié)調(diào)動作消失，水淹沒鼻尖，身體下沉，至再次浮出水面時長超過10 s，連續(xù)3次且放于游泳池外平臺無法完成翻正反射)建立大鼠疲勞模型.對B組大鼠采用力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練的方式建立疲勞模型，A組大鼠不進(jìn)行任何針對性活動安排.為使大鼠能夠適應(yīng)游泳，先讓其學(xué)習(xí)游泳3 d，第1 d游泳10 min，第2 d游泳15 min，第3 d游泳20 min，然后進(jìn)行5周的力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練.具體訓(xùn)練方案見表1.

表1 大鼠力竭游泳訓(xùn)練方案Tab. 1 Exhaustive swimming training program in rats

大鼠游泳時間采用每天逐漸增加的方式，時間增加的幅度依據(jù)大鼠每天游泳訓(xùn)練后的疲勞狀態(tài)和第2 d的活動情況來安排.負(fù)重采用小重量的螺絲帽，由鑰匙環(huán)串成，根據(jù)大鼠每日體質(zhì)量的百分比通過增減螺絲帽的數(shù)量來控制負(fù)重大小.負(fù)重由小皮筋連接綁在大鼠上肢的腋下部位.游泳訓(xùn)練過程中重點(diǎn)觀察大鼠動作的協(xié)調(diào)程度，當(dāng)大鼠動作出現(xiàn)明顯不協(xié)調(diào)、沉入水底后不能保持站立姿勢時，迅速撈起并用干毛巾擦干讓其休息5 min左右，之后再放入游泳池中[13].游泳訓(xùn)練期間，詳細(xì)觀察和記錄大鼠的運(yùn)動能力、疲勞狀態(tài)與活動情況.游泳池水深為50 cm，水溫29 ℃±1 ℃.

1.3 測試樣本的采集、處理與測試

在完成最后一次力竭游泳后24 h，采集B組大鼠股動脈血2 mL.A組大鼠同時間段取血，采集股動脈血2 mL.血液樣本采用3000 r/min離心5 min，收集上清液為血清，采用雙抗體夾心親和素-生物素復(fù)合-酶聯(lián)免疫吸附測定法(ABC-ELISA法)測試血清中IFN-γ、IL-4、IL-12、IL-27含量，測試方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行.

1.4 數(shù)理統(tǒng)計

2 實驗結(jié)果

2.1 B組大鼠游泳訓(xùn)練及活動情況

在力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練的第5周，B組大鼠溺水死亡2只，其余均完成運(yùn)動訓(xùn)練安排，因此B組實際納入本研究數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計的樣本為8個.游泳訓(xùn)練第1、2周，每天訓(xùn)練結(jié)束后大鼠活動逐漸減少，但在第2 d仍能恢復(fù)至訓(xùn)練前的精神狀態(tài).第3、4、5周隨著訓(xùn)練時間和負(fù)重的增加，每天訓(xùn)練結(jié)束后大鼠活動呈現(xiàn)明顯的疲勞狀態(tài)，出現(xiàn)肌力明顯減弱、軀干代替四肢支撐身體休息、在外力的驅(qū)趕下仍不活動等現(xiàn)象，且在第2 d疲勞狀態(tài)仍未恢復(fù)，飼養(yǎng)籠內(nèi)的活動明顯減少.

2.2 疲勞大鼠血清IFN-γ、IL-4含量變化

采用ABC-ELISA法對大鼠血清IFN-γ、IL-4含量進(jìn)行測試，并計算IFN-γ/IL-4比值，見表2.

表2 兩組大鼠IFN-γ、IL-4含量的比較Tab. 2 Comparison of IFN-γ、IL-4 between the two groups of rats

注：“★”表示與A組相比，P<0.05.

比較兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：B組大鼠血清IFN-γ含量(159.02±39.08 ng/L)低于A組(205.88±34.24 ng/L)，且存在顯著性差異(P=0.015)；B組大鼠血清IL-4含量(56.61±15.97 ng/L)高于A組(54.17±17.89 ng/L)，統(tǒng)計分析未呈現(xiàn)顯著性差異(P=0.767)；B組大鼠血清IFN-γ/IL-4比值(2.92±0.69)低于A組(4.12±1.35)，存在顯著性差異(P=0.037).

2.3 疲勞大鼠血清IL-12、IL-27含量的變化

采用ABC-ELISA法對大鼠血清IL-12、IL-27含量進(jìn)行測試，見表3.由表3可見，B組大鼠血清IL-12含量(42.20±13.41 ng/L)低于A組(57.60±15.86 ng/L)，且存在顯著性差異(P=0.044)；B組大鼠血清IL-27含量(17.70±6.06 ng/L)也低于A組(22.56±5.12 ng/L)，但未達(dá)到顯著性差異水平(P=0.084).

表3 兩組大鼠IL-12、IL-27含量的比較Tab. 3 Comparison of IL-12、IL-27 between the two groups of rats

2.4 大鼠血清IL-12、IL-27與IFN-γ的相關(guān)性

從Pearson相關(guān)性檢驗結(jié)果來看，大鼠血清IL-12與IFN-γ的含量顯著相關(guān)(r=0.704，P<0.01)，但血清IL-27與IFN-γ的含量無顯著相關(guān)(r=0.212，P>0.05)，血清IL-12與IL-27的含量也無顯著相關(guān)(r=0.074，P>0.05).

3 分析與討論

3.1 疲勞模型大鼠T1/T2平衡的變化

在免疫平衡中，T1/T2平衡主要用于反映細(xì)胞免疫與體液免疫之間的平衡狀態(tài).IFN-γ等細(xì)胞因子分泌相對增多或IL-4等細(xì)胞因子分泌相對減少，表明細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)，T1/T2平衡向T1方向偏移；反之，IL-4等細(xì)胞因子分泌相對增多或IFN-γ等細(xì)胞因子分泌相對減少，表明體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)，T1/T2平衡則向T2方向偏移.相比之下，IFN-γ/IL-4比值的變化更能直觀地反映T1/T2平衡的變化，該比值的增大和減小可直接反映細(xì)胞免疫與體液免疫之間的平衡變化.基礎(chǔ)研究認(rèn)為，機(jī)體的免疫機(jī)能需要在整體水平上保持動態(tài)平衡，在獲得性免疫階段，細(xì)胞免疫與體液免疫之間需保持動態(tài)平衡，不然將會導(dǎo)致疾病、造成病理損傷或加重病情[14].其中，未達(dá)到疾病的疲勞狀態(tài)也可能與細(xì)胞免疫和體液免疫的失衡有關(guān).為避免末次游泳訓(xùn)練所引起的應(yīng)激反應(yīng)對實驗結(jié)果造成影響，本研究將取材時間定為末次游泳訓(xùn)練后24 h.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疲勞模型大鼠血清IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，但血清IL-4含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05).此外，疲勞模型大鼠血清IFN-γ/IL-4比值也顯著降低(P<0.05).以上研究結(jié)果表明，疲勞模型大鼠會出現(xiàn)T1/T2失衡，表現(xiàn)為T1型免疫反應(yīng)抑制，細(xì)胞免疫功能下降，而T1/T2失衡可能是導(dǎo)致大鼠疲勞的重要誘因.同類研究中，蘇利強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)，10 d遞增負(fù)荷游泳至力竭后8 h，外周血血清IFN-γ水平與血清IFN-γ/IL-4比值均顯著下降[15]；5周遞增負(fù)荷游泳至力竭后24 h，外周血血清IFN-γ水平與血清IFN-γ/IL-4比值也均顯著下降(P<0.05)[12].另一項研究中，4周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練可引起大鼠血漿IFN-γ含量顯著降低(P<0.01)，血漿IFN-γ/IL-4比值也顯著降低(P<0.05)[16].以上研究與本研究結(jié)果呈現(xiàn)一致的變化趨勢.

3.2 疲勞模型大鼠IL-12、IL-27的變化及其與T1/T2平衡的關(guān)系

T1細(xì)胞的分化與IFN-γ的產(chǎn)生與細(xì)胞因子IL-12、IL-27的作用有關(guān),IL-12是T1細(xì)胞分化的啟動細(xì)胞因子[8].研究發(fā)現(xiàn)，用抗IL-12的血清耗盡IL-12或者基因敲除IL-12時，會抑制細(xì)胞因子IFN-γ的分泌[17].IL-12是由APC分泌、由p35與p40兩條多肽鏈通過二硫鍵共價結(jié)合形成的異二聚體(p70)[18]，通過與同樣由2條型的受體(IL-12R1、IL-12R2)形成[19]的IL-12R結(jié)合，啟動胞內(nèi)的Janus激酶(Janus kinase, JAK)/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription, STAT)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)與IFN-γ mRNA等的轉(zhuǎn)錄[20].IL-27同屬IL-12家族成員，也主要由APC分泌.與IL-12結(jié)構(gòu)類似，IL-27也是由兩條多肽鏈通過二硫鍵組成，分別為p28(IL-12 p35的相關(guān)多肽)和EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus induced gene 3, EBI3)，通過啟動胞內(nèi)不同JAK/ STAT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)IFN-γ 的分泌[21].此外，IL-12與IL-27在促進(jìn)T1細(xì)胞分化與IFN-γ產(chǎn)生的過程中還具有協(xié)同作用.

目前，疲勞機(jī)體T1/T2平衡與IL-12的關(guān)系已有相關(guān)研究進(jìn)行探討[16, 22-24]，但與IL-27的關(guān)系尚未見相關(guān)研究報道.美國學(xué)者以1-型單純皰疹病毒感染小鼠為實驗對象研究發(fā)現(xiàn)，在遞增負(fù)荷運(yùn)動至力竭并感染病毒2 d后，小鼠脾細(xì)胞分泌的IL-12與IFN-γ均顯著降低[23].日本學(xué)者以運(yùn)動員為實驗對象研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動后運(yùn)動員血漿IFN-γ活性下降，而血漿IL-12p40(IL-12的拮抗劑)卻顯著升高[24].我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，4周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練不僅可引起大鼠血漿IFN-γ含量顯著降低(P<0.01)、血漿IFN-γ/IL-4比值顯著降低(P<0.05)，還可引起大鼠血漿IL-12含量顯著降低(P<0.01)，且大鼠血漿IL-12與IFN-γ的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)[16].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疲勞模型大鼠血清IFN-γ含量與IL-12含量均顯著低于正常對照組(P<0.05)，但血清IL-27含量與正常對照組相比無顯著性差異.此外，大鼠血清IL-12與IFN-γ的含量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，但血清IL-27與IFN-γ含量、IL-12與IL-27含量之間均無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05).

4 結(jié)論

經(jīng)過5周力竭游泳運(yùn)動訓(xùn)練，疲勞大鼠出現(xiàn)T1/T2失衡，表現(xiàn)為T1型免疫反應(yīng)抑制，細(xì)胞免疫功能下降，而T1/T2失衡是導(dǎo)致大鼠疲勞的重要誘因.疲勞大鼠T1/T2平衡的變化與IL-12分泌的變化有關(guān)，但與IL-27分泌的關(guān)系并不密切.

本研究中:(1)疲勞模型組大鼠負(fù)重游泳運(yùn)動強(qiáng)度較大，導(dǎo)致2只大鼠在力竭游泳過程中溺水死亡，最后實際納入本研究數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計的樣本僅為8個.未來的相關(guān)實驗研究應(yīng)注意觀察大鼠游泳過程中動作的協(xié)調(diào)程度，預(yù)判大鼠的疲勞狀態(tài)并及時做好救護(hù)準(zhǔn)備.(2)受研究經(jīng)費(fèi)等的限制，本研究僅觀察了末次訓(xùn)練后24 h一個時相，研究結(jié)果雖能揭示疲勞大鼠T1/T2平衡的變化，但無法深入了解在大鼠疲勞發(fā)生發(fā)展過程中T1/T2平衡的變化和作用，建議未來的相關(guān)實驗研究增加如末次訓(xùn)練后8、24、72 h等時相的觀察.