張純剛，唐靜雅，于琛琛，程蘭，康廷國

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116620；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，遼寧 大連 116620)

黃連味苦，性寒，歸心、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。黃連中含有小檗堿、巴馬汀堿、黃連堿，表小檗堿等生物堿都具有較強的藥理活性?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連主要有效成分生物堿類不僅具有抗菌、抗病毒的功效，還具有抗心律失常、改善充血性心力衰竭、擴張冠狀動脈、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、利膽、抗腫瘤等藥理作用，被廣泛應用于各種病證的治療[1]。因此，對黃連五種主要生物堿提取與純化工藝進行研究對于臨床研究有著重要的意義。黃連提取純化方法很多種，有水提、醇提以及柱層析純化等[2-7]。《中華人民共和國藥典》2015年版一部黃連含量測定項下一測多評法及相關文獻報道同時測定四種生物堿的含量[8-15]。本實驗采用硫酸水提結合酸溶鹽析沉淀的方法提取純化生物堿，通過優(yōu)化方法同時檢測五種含量較大的生物堿，并計算五種生物堿的含量?；谝陨辖Y果，為后續(xù)進行的降血糖方面制劑研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Agilent 1100 series(美國安捷侖科技有限公司)；硫酸、氯化鈉為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)。黃連(批號：C150677)由大連權健中藥飲片有限公司提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學康廷國教授鑒定為正品黃連Coptidis Rhizoma。鹽酸小檗堿對照品、鹽酸藥根堿對照品、鹽酸黃連堿對照品、鹽酸表小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為Y18N8S48598、Z27A6S2808、ZS0924BE14、H25F3X1、Z23O6L4910，純度≥98%)。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對照品、鹽酸黃連堿對照品、鹽酸表小檗堿對照品、鹽酸巴馬汀為對照品及鹽酸藥根堿對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含51 μg鹽酸小檗堿、10.2 μg鹽酸黃連堿、17.6 μg鹽酸表小檗堿、8.6 μg的鹽酸巴馬汀及2.4 μg鹽酸藥根堿的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)提取后的黃連提取物粉末約0.2 g，置50 mL容量瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)溶解，超聲處理30 min，放冷至室溫后續(xù)加甲醇-鹽酸(100∶1)定容。精密吸取上述溶液2 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)進行定容，再經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 固定相：Eclipse XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(45∶55)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節(jié)pH 4.0)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測波長：345 nm；進樣量：10 μL。

2.2 黃連中總生物堿含量測定的方法學建立

2.2.1 專屬性試驗 分別吸取空白及對照品溶液和供試品溶液，按2.1.3項下色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖(圖1)。結果表明，在上述色譜條件下五種成分的分離情況及峰形良好，專屬性良好。

注：A.供試品；B.對照品；C.空白；1.鹽酸藥根堿；2.鹽酸表小檗堿；3.鹽酸黃連堿；4.鹽酸巴馬?。?.鹽酸小檗堿。圖1 黃連五種生物堿HPLC圖譜

2.2.2 線性關系 將對照品溶液依次進樣2、4、8、10、16、20 μL。得鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的回歸直線方程及線性范圍，結果見表1。

表1 五種生物堿的回歸方程及線性范圍

2.2.3 精密度試驗 取五種生物堿混合對照品溶液，各重復進樣 6 次，測得鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積的RSD依次為1.13%、1.47%、1.76%、1.27%、1.10%，RSD<2%，精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 按既定方法制備供試品溶液，分別于2、4、6、8 h進樣10 μL檢測。結果鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的RSD依次為0.87%、0.31%、0.97%、0.30%、1.89%，RSD<2%，說明樣品在8 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復性試驗 取同一批次的樣品6份，照上述制定的方法制備供試品溶液和進行HPLC 測定，測得鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積的RSD依次為1.44%、1.64%、1.92%、1.63%、1.70%，RSD<2%，本方法重復性良好。

2.2.6 回收率試驗 采用加樣回收率方法考察回收率，結果鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的平均回收率依次為99.85%、100.08%、99.09%、99.69%、101.65%，RSD依次為1.66%、1.50%、1.18%、0.79%、1.34%。表明方法準確可靠。

2.2.7 樣品含量測定 按上述色譜條件，以混合對照液進行計算，對鹽酸藥根堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿五種生物堿進行含量測定，計算五種生物堿含量之和。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 酸濃度考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，分別加0.5%、1.5%、2.5%的硫酸溶液80 mL，加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并濾液，用水定容至200 mL，取上述提取液適量，用甲醇稀釋到適當濃度，經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾，按照2.2.7 樣品含量測定項下進行測定，測得5種生物堿含量并加和，計算5種主要生物堿的提取率，結果見表2。

表2 酸濃度對五種主要生物堿提取率的影響

從表2 結果可知，隨著酸濃度的升高，黃連五種主要生物堿提取率先升高后下降。酸濃度在1.5%時五種主要生物堿提取率達到最高值。

2.3.2 提取時間考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，加1.5%硫酸溶液80 mL，分別加熱回流提取20、40、60 min，提取3次，濾過，合并濾液，用水定容至200 mL，即得，結果見表3。

表3 提取時間考察試驗結果

從表3 結果可知，隨著提取時間的延長，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，40 min時和60 min時五種主要生物堿提取率相差較小，因此推測再繼續(xù)延長時間五種主要生物堿提取率并不會增加，因此選擇40 min時黃連五種主要生物堿提取效率最佳。

2.3.3 加液量考察 取黃連飲片粉末約10 g，共3份，分別加1.5%硫酸溶液40、80、120 mL，加熱回流提取3次，每次40 min，濾過，合并濾液，分別用水定容至合適體積，即得，結果見表4。

表4 加液量考察試驗結果

從表4 結果可知，隨加液量的增加，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，繼續(xù)增加加液量五種主要生物堿提取率并沒有繼續(xù)提高，加液量為80 mL時黃連五種主要生物堿提取效率最佳。

2.3.4 提取次數(shù)考察 取黃連飲片粉末約10 g，共4份，分別加1.5%硫酸溶液80 mL，加熱回流分別提取1次、2次、3次、4次，40 min/次，濾過，合并濾液，分別用水定容至200 mL，即得，結果見表5。

表5 提取次數(shù)考察試驗結果

從表5結果可知，隨著提取次數(shù)的增加，黃連五種主要生物堿提取率逐漸提高，當提取次數(shù)為4次時最高，但是提取3次與提取4次差別很小，考慮提取效率因素，提取3次的黃連五種主要生物堿提取率最優(yōu)。

2.4 黃連總生物堿純化工藝研究

2.4.1 Ca(OH)2中和條件的考察 取黃連提取液4份，每份50 mL，分別用Ca(OH)2調節(jié)pH 5～6、pH 7、pH 8～9、pH 10，濾過后的濾液分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。取上述濾液1 mL，加甲醇定容至25 mL，過0.22 μm微孔濾膜，照上述含量測定中要求測定黃連總生物堿含量。取上述各濾液40 mL，分別加鹽酸調節(jié)pH 1.5～2，加氯化鈉4 g，使用漩渦儀攪勻使溶解，在冰箱中靜置過夜，抽濾，干燥，收集純化物，所制得的純化物主要是由五種主要生物堿組成的，結果如表6。

試驗結果表明，pH 5～6 時，黃連中五種主要生物堿加和的得率最大且純化物純度較高。采用Ca(OH)2中和硫酸，并濾除沉淀，在沉淀過程中會有部分生物堿沉淀析出，造成過濾后生物堿的部分損失，但是經(jīng)過Ca(OH)2中和硫酸濾除沉淀后，得到的純化后的生物堿固體純度更高了，對后續(xù)制備高載藥量的黃連生物堿降糖制劑奠定了基礎。

表6 Ca(OH)2中和條件下不同pH值考察試驗結果

2.4.2 酸沉條件考察 取黃連提取液400 mL，加Ca(OH)2調節(jié)pH 5～6，抽濾。分別量取濾液3份，每份100 mL，用鹽酸分別調節(jié)pH 1.5～2、pH 2～3、pH 3～4，每份樣品均加氯化鈉10 g，使用漩渦儀攪勻使溶解，在冰箱中靜置過夜，抽濾，濾渣在干燥箱中真空干燥(50 ℃)，收集純化物。結果如表7。

表7 鹽酸酸化下不同pH考察結果

試驗結果表明，當黃連提取液進行酸沉實驗時，隨著pH 升高，黃連中五種主要生物堿的得率變小，純化物純度降低，pH 為1.5～2時為最優(yōu)。

2.5 黃連五種主要生物堿含量測定

取黃連提取液1000 mL，共3份，分別加Ca(OH)2調節(jié)pH 5～6，抽濾，濾液加鹽酸調節(jié)pH 1.5～2，加氯化鈉100 g，充分攪拌，后在冰箱冷藏靜置過夜，抽濾，濾渣干燥(50 ℃)，收集純化物。含量測定結果見圖2。

圖2 黃連五種主要生物堿含量測定結果

3 結論與討論

黃連提取率最優(yōu)條件是：研磨黃連呈粉末狀，加8倍量1.5%的硫酸溶液，煎煮三次，每次40 min。硫酸濃度不宜過高，以免提取時由于水分蒸發(fā)，局部濃度過高產生碳化的現(xiàn)象。

五種主要生物堿純化物純度最優(yōu)條件是：黃連提取液采用Ca(OH)2調節(jié)pH 5～6，濾液加HCl調節(jié)pH 1～2，加5%氯化鈉溶液使之溶解，冰箱冷藏過夜，濾餅50 ℃烘干。在黃連生物堿純化過程中，向提取液中加入Ca(OH)2中和硫酸時，由于Ca(OH)2微溶于水，與硫酸反應時間較長，因此加入Ca(OH)2后需不斷攪拌，以促進Ca(OH)2與硫酸充分反應。如果攪拌不充分，則pH測定不準確，對沉淀提純的結果有較大的影響。雖然在沉淀提純過程中，有少部分生物堿的損失，不能完全提取純化出來，但是由于得到的五種主要生物堿純化物的純度較高，為制備高載藥量的黃連生物堿降糖制劑奠定了較好的基礎，得到了純度較高的原料藥。

黃連五種主要生物堿的采用高效液相色譜法進行含量測定方法，五種生物堿分離度符合要求，方法精密度、準確穩(wěn)定可靠，檢測結果準確。