張曉婉，黃健，宋冬梅，董育瑄，王晶，路金才，賈凌云*

(1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧和悅醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽 110180)

遼細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.為馬兜鈴科植物北細(xì)辛、漢城細(xì)辛的干燥根及根莖，主產(chǎn)于遼寧的撫順、丹東、吉林長白山以及黑龍江等地。細(xì)辛具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲等功效[1]?，F(xiàn)代市場上常見的細(xì)辛干燥方法一般都陰干，該方法干燥時(shí)間長，不僅影響中藥草質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值同時(shí)也直接影響產(chǎn)品的使用和外觀[2]。而細(xì)辛的主要化學(xué)成分包括甲基丁香酚、細(xì)辛脂素、黃樟醚、欖香素等揮發(fā)性成分以及木脂素類的細(xì)辛脂素和痕量的馬兜鈴酸[3-4]。其中馬兜鈴酸A在長期服用后可引起肝臟和腎臟的損壞與衰竭[5]，因此馬兜鈴酸的含量對于細(xì)辛藥材的安全性起到了關(guān)鍵的作用。因此，本文通過檢測甲基丁香酚、細(xì)辛脂素以及馬兜鈴酸三種成分為指標(biāo)，對不同年限以及不同干燥方法進(jìn)行分析比較，為完善細(xì)辛采收和后續(xù)加工方法提供科學(xué)依據(jù)[6]，3種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 馬兜鈴酸(a)、細(xì)辛脂素(b)、甲基丁香酚(c)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

Waters 2707-2489-1525分析液相，WD900B型微波爐(輸出功率900W，額定微波功率2450 MHz，順德格蘭仕電器廠有限公司)，WS70-1型紅外線快速干燥器(功率500 W，電壓220 V，上海錦屏儀器儀表有限公司)，SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，BS124S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，KQ5200E型數(shù)控超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)，高速多功能粉碎機(jī)(28000 r·min-1，上海緣沃工貿(mào)有限公司)，XMTH數(shù)顯控溫儀(浙江余姚市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠)，RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)。

馬兜鈴酸A、細(xì)辛脂素對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%，批號分別為wkq15122902、wkq16071301)，甲基丁香酚對照品(中國藥品生物制品鑒定所，批號為111642-200301)，甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

野生遼細(xì)辛新鮮藥材于2017年9月，采自遼寧省撫順市北四平鄉(xiāng)，由沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈凌云副教授鑒定為遼細(xì)辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)kitag.。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)辛的干燥品制備

測定所用的干燥品均用六年生遼細(xì)辛鮮品30 g進(jìn)行干燥，以連續(xù)兩次干燥后稱重的差異小于5 mg為指標(biāo)判斷干燥是否完全。不同干燥方法處理后的干燥品的質(zhì)量約為14 g，最后確定的干燥時(shí)間為：陰干12 d、50 ℃烘干6 h、70 ℃烘干1.5 h、微波干燥4 min、紅外干燥1 h、凍干1 h。

2.2 HPLC法測定馬兜鈴酸、細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的含量

2.2.1 馬兜鈴酸、細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的色譜條件和系統(tǒng)適用性 色譜柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)為72：28等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：316 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫30 ℃。在此色譜條件下，理論塔板數(shù)以馬兜鈴酸A計(jì)算不得低于5000，相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，色譜圖見圖2。

圖2 馬兜鈴酸對照品溶液色譜圖

色譜柱：COSMOSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脫程序：0～10 min，?(A)55%～60%；10～15 min，φ(A)60%～65%；15～30 min，φ(A)65%～71%；30～35 min，φ(A)71%～55%；流速：1.0 mL· min-1；檢測波長：285 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫30 ℃。在此色譜條件下，理論塔板數(shù)以細(xì)辛脂素計(jì)算不低于10 000，相鄰兩峰的分離度應(yīng)大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，色譜圖見圖3。

圖3 對照品溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照儲(chǔ)備液 取馬兜鈴酸A 10.16 mg，置25 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，再吸取1 mL置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，獲得濃度為40.64 mg·L-1的馬兜鈴酸A對照儲(chǔ)備液。另取甲基丁香酚10.53 mg，細(xì)辛脂素14.46 mg分置10 mL容量瓶，再分別取1 mL和0.5 mL的儲(chǔ)備液于10 mL的容量瓶中，分別獲得濃度為105.3 mg·L-1和72.3 mg·L-1作為細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的混和對照儲(chǔ)備液。

2.2.2.2 供試溶液 取不同年限及不同干燥方法的遼細(xì)辛藥材粉末各1 g，置25 mL錐形瓶中，超聲提取3次，每次加5 mL分析甲醇。過濾后合并提取液，甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，過濾(0.22 μm)，取續(xù)濾液即為馬兜鈴酸的供試溶液。再取不同年限及不同干燥方法的遼細(xì)辛藥材粉末各0.5 g，置100 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，稱重。水浴回流1小時(shí)，取出，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，過濾(0.22 μm)，取續(xù)濾液即為細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的混合供試溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取馬兜鈴酸A對照儲(chǔ)備液0.5、1.5、2.5、3.5、5.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。各吸取10 μL進(jìn)行液相分析，再精密吸取“2.3.2.1”項(xiàng)下的對照品溶液1、2、4、8、10 mL細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的混和對照儲(chǔ)備液，按照上述方法獲得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液后，各吸取5 μL進(jìn)行液相分析。以對照儲(chǔ)備液峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以溶液的質(zhì)量濃度(ρ，mg·L-1)橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到馬兜鈴酸A的回歸方程為：A=1.433 5×104ρ+1.06×103，r=0.999 2；甲基丁香酚的回歸方程為：A=7×108ρ+4.431 62×105，r=0.999 2；細(xì)辛脂素的回歸方程為：A=2×109ρ+5.218 68×105，r=0.999 3結(jié)果表明，馬兜鈴酸A、甲基丁香酚以及細(xì)辛脂素的質(zhì)量濃度分別在2.032～22.352 mg·L-1、10.53～105.3 mg·L-1及7.23～723 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取馬兜鈴酸對照儲(chǔ)備液10 μL及混合對照儲(chǔ)備液5 μL，在“2.2.1”條色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，其馬兜鈴酸的RSD值為1.54%，細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的RSD值分別為1.74%、1.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取六年生陰干的遼細(xì)辛藥材約1 g，按照“2.2.2.2”條方法平行制的6份供試溶液，按照“2.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，測得馬兜鈴酸A含量的RSD值為0.94%，另取六年生陰干的遼細(xì)辛藥材約0.5 g，同理測得其細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的含量的RSD值分別為1.82%、1.14%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取馬兜鈴酸供試溶液分別于0、2、4、6、8、12 h吸取10 μL注入液相色譜儀，按照“2.2.1”條色譜條件測定峰面積，測得馬兜鈴酸A峰面積的RSD值為1.14%，同理取細(xì)辛脂素和甲基丁香酚混合供試溶液以相同的時(shí)間點(diǎn)各吸取5 μL注入液相色譜儀，測得其細(xì)辛脂素和甲基丁香酚峰面積的RSD值分別為1.08% 、0.69%，表明供試品溶液在室溫下穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率 稱取已知含量的遼細(xì)辛藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱定。按照“2.2.2.2”條方法制備供試溶液，并精密加入馬兜鈴酸對照儲(chǔ)備液適量，按照“2.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算馬兜鈴酸回收率，結(jié)果見表1。

表1 馬兜鈴酸A的加樣回收率的結(jié)果

再稱取已知含量的細(xì)辛藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定。按照同樣方法制備供試溶液，并精密加入混合對照儲(chǔ)備液適量，按照“2.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.2.8 樣品含量測定 取不同年限和不同干燥方法的遼細(xì)辛藥材三份，按照“2.2.2.2”條方法制備供試溶液，在“2.2.2.1”的條件下，分別精密吸取不同年限和不同干燥的供試品溶液各10 μL進(jìn)入液相，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品中馬兜鈴酸的含量，并計(jì)算其他干燥品相對于六年生陰干中馬兜鈴酸的含量變化率，結(jié)果見圖3和圖4。

表2 細(xì)辛脂素和甲基丁香酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

圖4 不同年限馬兜鈴酸A的含量

圖5 不同干燥方法處理后馬兜鈴酸A的含量

再取不同年限和不同干燥方法的遼細(xì)辛藥材三份，按照上述同樣的方法制備供試溶液并分別吸取5 μL進(jìn)入液相計(jì)算其甲基丁香酚和細(xì)辛脂素的含量及其他干燥品相對于六年生陰干中甲基丁香酚和細(xì)辛脂素的含量變化率，結(jié)果見表3和表4。

表3 不同年限中細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的含量

表4 不同干燥方法處理后細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的含量

3 討論與結(jié)論

細(xì)辛藥材中馬兜鈴酸的含量屬于痕量，因此考察了藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[7-10]的檢測波長，結(jié)果表明馬兜鈴酸在316 nm處顯示有吸收，故選擇316 nm為檢測波長。

分別考察了流動(dòng)相系統(tǒng)在梯度洗脫的條件下對細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的分離情況，發(fā)現(xiàn)使用甲醇-0.1%甲酸水的系統(tǒng)梯度洗脫時(shí)分離度相對較好且峰型良好。故選擇采用甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

不同年限細(xì)辛中馬兜鈴酸A測定結(jié)果表明，馬兜鈴酸A的含量隨著年限的增長而下降，不同方法干燥處理后，馬兜鈴酸A的含量并未呈明顯的趨勢性變化且馬兜鈴酸A的含量均在國家藥典規(guī)定的0.001% 以下。

現(xiàn)今市場上流通的細(xì)辛藥材大多都采用陰干的方式來進(jìn)行加工處理，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用冷凍干燥法對細(xì)辛藥材加工過程中有效成分的保留起到一定的作用，有條件的企業(yè)可以選擇此方法。此外，低溫干燥有效成分損失也較小，更適用大規(guī)模干燥。

細(xì)辛脂素和甲基丁香酚的含量隨著細(xì)辛種植年限越長，整體的含量也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，其中6年生的細(xì)辛藥材的有效成分含量要優(yōu)于其他年限，但與5年生相差不大，考慮種植成本等因素，細(xì)辛的采收年限為5年較合理。