張嚴(yán)磊，施歡賢，李世映，段金廒，宋忠興，唐志書

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083)

文冠果XanthocerassorbifoliaBunge屬無患子科Sapindaceae文冠果屬，該植物較特殊，是一屬一種，原產(chǎn)中國西北，屬木本油料植物，為中國特有的民間植物[1]。其葉[2]、花[3]、果殼[4]、果柄[5]、種皮[6]等皆含有多種化學(xué)成分，有抗風(fēng)濕、祛風(fēng)、消腫止痛等功效，是傳統(tǒng)蒙藥的一種，臨床上主要用其莖稈治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[7-10]。文冠果是國家戰(zhàn)略儲備木本油料作物之一，目前對于文冠果資源的開發(fā)利用，主要以文冠果種仁油為主；文冠果的莖葉以及果殼、種皮等基本沒有開發(fā)利用。本課題組前期圍繞文冠果資源的葉和果殼做了大量工作，發(fā)現(xiàn)文冠果葉提取物[11]及多糖[12]皆有明顯的生物活性。文冠果殼占了文冠果果實(shí)生物質(zhì)量的很大一部分，但是基本當(dāng)作廢棄物處理。本課題組前期利用文冠果殼制備了糠醛及活性炭，實(shí)現(xiàn)了文冠果廢棄物資源的高值化開發(fā)利用。本文將就其提取物抑制人體HepG2細(xì)胞的增殖生物活性進(jìn)行探索性研究，從而為文冠果資源的綜合開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和材料

多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；高速離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國)；流式細(xì)胞儀(Thermo Fisher Scientific，美國)；電子顯微鏡(Olympus Japan)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)。

MTT(Sigma USA)；雙抗(Hyclone Utah)；DMEM培養(yǎng)基(Hyclone Utah)；四季青胎牛血清(Hyclone Utah)；絲裂霉素C(Sigma USA)；HepG2細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；PI(碘化丙啶)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；文冠果殼(陜西楊凌普天農(nóng)業(yè)科技有限公司)。

2 方法

2.1 樣品提取與所需溶液的配制

2.1.1 樣品的提取 分別稱取6份文冠果殼粉末，每份2.00 kg，按料液比例(m/V)1∶10，分別加入水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇水溶液，水浴回流提取，總共提取3次、每次1 h，過濾，合并濾液。濾液濃縮浸膏、冷凍干燥、粉碎，得文冠果殼提取部位(XSHE)A、B、C、D、E、F備用。

2.1.2 樣品溶液及對照品的配制 分別精密稱取對照品絲裂霉素C(MMc)和各文冠果殼提取部位粉末5.00 mg，分別用空白培養(yǎng)基溶解(超聲助溶)，并定容至5.00 mL，分別得到質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1的對照品溶液和質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1樣品溶液母液，-80 ℃保存，備用。

2.1.3 完全細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 往500.00 mL DMEM培養(yǎng)基中，按比例10∶1加入50.00 mL已滅活的胎牛血清，之后，加入5.00 mL的雙抗(100 U·L-1青霉素和100.00 μg·mL-1鏈霉素)，搖勻，即得。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞置于25.00 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用移液槍吸入5.00 mL的完全培養(yǎng)基，吹勻，放置于恒溫37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培育，待HepG2細(xì)胞生長達(dá)到95%融合度時，加入0.25%的胰蛋白酶2.00 mL消化，傳代，3 d傳代1次。

2.3 細(xì)胞凍存

待HepG2細(xì)胞生長達(dá)到95%匯合度時，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，加入2.00 mL的凍存液[空白培養(yǎng)基-二甲亞砜-胎牛血清(5∶4∶1)]，吹打，使HepG2細(xì)胞脫離瓶壁，之后將HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管中，分別在4 ℃、-20 ℃恒溫30 min、-80 ℃恒溫72 h后，液氮保存。

2.4 不同溶劑XSHE抑制HepG2細(xì)胞增殖活性部位篩選

2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 空白組：100.00 μL完全DMEM培養(yǎng)基；樣品組：質(zhì)量濃度分別為25.00、50.00、100.00 μg·mL-1文冠果殼不同溶劑提取物；每組設(shè)6個復(fù)孔。

2.4.2 HepG2細(xì)胞增殖活性檢測 待HepG2細(xì)胞生長達(dá)到95%匯合時，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化后，加入2.00 mL的完全培養(yǎng)基，吹打，使HepG2細(xì)胞脫落瓶壁。之后用移液槍將細(xì)胞吹勻，計(jì)數(shù)后，按細(xì)胞接種濃度為2×105個·mL-1用培養(yǎng)基調(diào)整，接種至96孔板上，接種體積為100.00 μL/孔。放置于5% CO2的培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后將100.00 μL“2.4.1”中各組藥物加至96孔板中，培養(yǎng)24 h后將MTT溶液15.00 μL加至各培養(yǎng)孔，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后去除培養(yǎng)基，加入150.00 μL DMSO，放回培養(yǎng)箱，孵育15 min后在波長450 nm下測吸光度(A)值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率(%)=[1-(A空白-A樣)/A空白]×100%

(1)

2.5 95% XSHE對HepG2細(xì)胞增殖及細(xì)胞形態(tài)的影響

2.5.1 實(shí)驗(yàn)分組 空白組：100.00 μL完全DMEM培養(yǎng)基；陽性對照(MMc)組：質(zhì)量濃度為75.00 μg·mL-1；樣品組：質(zhì)量濃度分別為12.50、25.00、50.00、75.00 μg·mL-1的95% XSHE；每組設(shè)6個復(fù)孔。

2.5.2 95%XSHE干預(yù)后HepG2細(xì)胞增殖活性檢測待HepG2細(xì)胞生長達(dá)到95%融合時，用2.00 mL 0.25%的胰蛋白酶消化后，加入2.00 mL的完全培養(yǎng)基，用移液槍吹打，使細(xì)胞脫落瓶壁。輕輕將細(xì)胞吹勻，在計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按細(xì)胞接種濃度為2×105個·mL-1用培養(yǎng)基調(diào)整，接種至96孔板上，接種體積為100.00 μL/孔。放置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，將100.00 μL 2.5.1中各組藥物加至96板中，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，之后將15.00 μL MTT溶液加至培養(yǎng)孔放入培養(yǎng)箱孵育4 h后去除培養(yǎng)基，加入150.00 μL DMSO，放回培養(yǎng)箱，孵育15 min后在波長450 nm下測A值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率。此外，在電鏡下，觀察HepG2細(xì)胞在不同濃度的95%XSHE干預(yù)后的形態(tài)變化，拍照，分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 不同溶劑XSHE抑制HepG2細(xì)胞增殖活性的篩選結(jié)果

利用經(jīng)典的MTT法分析文冠果殼各溶劑提取物對HepG2活力的影響，結(jié)果如圖1所示。在25.00～100.00 μg·mL-1，文冠果殼各提取物中除文冠果殼水提物、文冠果殼10%乙醇水溶液(10% XSHE)表現(xiàn)出促進(jìn)HepG2增殖作用外。其余溶劑提取物對HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的毒性作用，且與空白組相比有顯著性差異(P< 0.01)。其中，95% XSHE對HepG2細(xì)胞活力的抑制效果尤為明顯，且表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。當(dāng)95% XSHE給藥質(zhì)量濃度為100.00 μg·mL-1時，其對HepG2細(xì)胞毒性作用達(dá)到(72.68±0.21)%。

注：與空白組對比，**P<0.01，*P< 0.05；下同。圖1 不同溶劑XSHE對HepG2細(xì)胞抑制作用

3.2 95% XSHE對HepG2細(xì)胞增殖的影響

基于3.1初步篩選結(jié)果，本課題組進(jìn)一步研究95% XSHE與HepG2細(xì)胞增殖之間的量效關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。不同濃度95% XSHE對HepG2細(xì)胞活力均展現(xiàn)了較好的抑制作用，相較于空白組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且給藥濃度與HepG2細(xì)胞存活率之間表現(xiàn)出良好的負(fù)相關(guān)性，當(dāng)95% XSHE給藥濃度為75.00 μg·mL-1時，其對HepG2細(xì)胞增殖的抑制率高達(dá)(80.44±2.33)%，高于等濃度的陽性對照MMc組(P<0.05)。

圖2 95% XSHE對HepG2細(xì)胞增殖的影響

3.3 95% XSHE對HepG2 細(xì)胞形態(tài)的影響

通過比較各組細(xì)胞形態(tài)，可以看出HepG2細(xì)胞在不同濃度95% XSHE干預(yù)后其形態(tài)有較為明顯變化，結(jié)果如圖3所示。正常情況下，HepG2細(xì)胞貼壁緊湊，細(xì)胞間隙小，形態(tài)不一，假足向周圍鋪展，邊緣難分；與空白組相比，HepG2細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度95% XSHE干預(yù)后，細(xì)胞皺縮，并且隨著給藥質(zhì)量濃度的上升，細(xì)胞皺縮越發(fā)明顯，細(xì)胞間隙變得更大，尤其是在質(zhì)量濃度為75.00 μg·mL-1的95% XSHE干預(yù)下，細(xì)胞皺縮成圓形尤為明顯，細(xì)胞假足幾乎不向周圍鋪展，邊緣易見，細(xì)胞間隙最大，并且有從培養(yǎng)板脫落的趨勢。而在陽性藥MMc干預(yù)下，細(xì)胞同樣可見上述現(xiàn)象，且漂浮于培養(yǎng)板。

圖3 95% XSHE對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

4 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果顯示，在25.00～100.00 μg·mL-1，文冠果殼各提取物中除水提物、10%乙醇水溶液的XSHE對HepG2細(xì)胞活力沒有明顯抑制作用外，文冠果殼其余溶劑提取物均對HepG2細(xì)胞活力有抑制作用，相較于空白組而言，皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.01)。其中，95% XSHE抑制HepG2細(xì)胞活力效果最強(qiáng)，當(dāng)95% XSHE 的給藥質(zhì)量濃度為75.00 μg·mL-1時，其抑制作用能達(dá)到(80.44±2.67)%，高于等質(zhì)量濃度的陽性對照MMc。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為100.00 μg·mL-1的95% XSHE對HepG2細(xì)胞的抑制作用不如75.00 μg·mL-1的95% XSHE強(qiáng)；分析認(rèn)為，可能是由于100.00 μg·mL-1的XSHE對HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)了一定的促增殖作用，也可能是藥物質(zhì)量濃度過大，在酶標(biāo)儀下有較大的吸收，從而干擾了測量結(jié)果。HepG2細(xì)胞在95% XSHE干預(yù)下形態(tài)發(fā)生變化，具體表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙變大，從培養(yǎng)板脫落等作用。

綜上結(jié)果表明，冠果殼提取物在體外具有良好的抑制HepG2增殖的生物活性，為我們進(jìn)一步探索文冠果殼提取物抗腫瘤作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。