趙童瑤，尹海波，李旭，陶玲，楊婷婷，劉洪嬌

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600)

龍膽作為常用的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]，為龍膽科Gentianaceae植物條葉龍膽GentianamanshuricaKitag.、龍膽GentianascabraBge.、三花龍膽Gentianatriflorapall.或堅龍膽GentianarigescensFranch.的干燥根及根莖[3]。在我國廣泛分布，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古，浙江、湖南、江西、福建、江蘇、廣東、新疆也有分布[4]。并且很多種類都具有重要的藥用價值，藥用資源開發(fā)潛力巨大[5]。其味甚苦，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，是中醫(yī)治療肝膽疾病的常用藥之一。龍膽臨床使用時有“味越苦，質(zhì)越優(yōu)”的說法，龍膽中所含的龍膽苦苷，具有強烈苦味活性，是龍膽中藥顯苦寒的主要因素[6-7]。因此苦味可作為評價龍膽中藥品質(zhì)的主要指標。并且由于“入口則知味，入腹則知性”[8]，一直以來中藥味道主要經(jīng)由口嘗獲得，但是由于個人評價的感覺差異和描述的主觀性，歷代醫(yī)學典籍對中藥味道的描述并不一致[9]。現(xiàn)今，人們?nèi)匀豢扛泄賮碓u價味道，即用人的感覺器官來辨別，獲取藥物的真實味道。但人為感官描述主觀性強，且量化標準、準確度和重復性方面的把握仍有欠缺，而且中草藥的成分分析極其困難。對中草藥成分進行定性定量分析，如果僅用傳統(tǒng)的光譜、色譜技術，將定量化的指標對應到苦度計算，將會是一個耗時而又費力的處理過程。

近年來發(fā)展起來的電子舌(electronic tongue，E-tongue)是一種運用味覺指紋分析技術[10](Gustation Fingerprint Analytical Technique，GFAT)模擬人體味覺器官的仿生學儀器[11]，是一種分析、識別液體“味道”的新型檢測手段。它是基于味覺傳感器和化學信息學處理方法的味覺識別檢測技術。它得到的是樣品的整體信息，而不是被測樣品中某種或某幾種成分的定性與定量結果，又被稱作“指紋”數(shù)據(jù)[12-13]。電子舌技術最早廣泛用于食品領域檢測，但藥食同源，中藥材也是來源于自然界的動植物和部分礦物[14]。并且與人體感覺器官舌頭相比，電子舌具有超強的客觀性、良好的重復性、工作不疲勞、快捷的檢測速度和數(shù)據(jù)電子化等特殊優(yōu)勢[15]。故將電子舌應用于對中藥味道的評價有良好的可行性[16]?；诖宋覀兪占瞬煌a(chǎn)地的龍膽藥材10份，并利用電子舌技術對龍膽進行苦味與品種及品質(zhì)有無相關性的分析。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，F(xiàn)100型粉碎機(上海高致精密儀器有限公司)，電子天平BP211D(0.01 mg)(上海精密科學儀器有限公司)，超純水制備儀Milli-Q(密理博(中國)有限公司)，電子舌α-Astree II(7枚電極：ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB)(法國Alpha MOS公司)

1.2 藥材與試劑

龍膽苦苷對照品；獐牙菜苦苷對照品；獐牙菜苷對照品。龍膽藥材飲片10批，產(chǎn)地分別為來源于云南(購買地為石家莊)、四川、黑龍江、吉林、安徽、云南(購買地為安國)、新賓旺清門、吉林通化、本溪桓仁、清原。

2 實驗方法

α-ASTREE Ⅱ電子舌系統(tǒng)(法國Alpha MOS公司，見圖1)：由第一套傳感器陣列(食品飲料專用，7個味覺傳感器ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB和1個氯化銀參比電極)、16位自動進樣器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及Alphasoft V12工作站軟件組成。電子舌經(jīng)活化、校正、診斷通過，確保采集得到的數(shù)據(jù)可靠、穩(wěn)定。室溫條件下進行測定，每份樣品體積為80 mL。電子舌傳感器在每個樣品中的采集時間為120 s，每秒采集1個數(shù)據(jù)，提取第120 s時響應值作為測定數(shù)值；每測一個樣品，都在水中清洗10 s，每份樣品重復測定7次，選取響應趨于穩(wěn)定的最后3次的測定數(shù)據(jù)用于計算。

圖1 龍膽提取物的電子舌測定精密度試驗PCA結果(n=3)

2.1 液相分析分析

2.1.1 供試品溶液的制備 藥材用粉碎機粉碎，取粉碎的藥材粉末0.3 g，過40目篩然后加入甲醇10 mL超聲30 min。用普通漏斗過濾，取濾液之后再用微孔濾膜過濾。取液裝入EP管中標號。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品、獐牙菜苦苷對照品、獐牙菜苷對照品適量，加甲醇超聲溶解定容，搖勻，作為對照品貯備溶液。

2.2 電子舌分析

2.2.1 電子舌粉末制備 取50 g藥材加入10倍量的水，浸泡半小時，煎煮30 min(煮沸10 min)，將煎出液倒出，再加入8倍量的水，煎煮30 min(煮沸10 min)，將煎出液倒出，再重復一次，共煎煮3次，合并3次煎煮液。每次煎煮都要加入0.2 g的碳酸鈣以防止酶和有機酸影響藥材中的活性成分。用小火熬制合并液使其能放入蒸發(fā)皿中，之后用40 ℃水浴加熱成干粉狀稱取1.0 g裝入EP管中標明產(chǎn)地。

2.2.2 樣品濃度的確定 電子舌的測定原理為分別測定并記錄7枚電極對樣品溶液的響應值，原始數(shù)據(jù)為電勢差。鑒于此原理，電子舌的響應值與樣品濃度(基質(zhì)溶液的離子濃度和強度)正相關，且靈敏度極高。根據(jù)電子舌對中藥提取物的響應規(guī)律，常用的樣品測試濃度為0.625～1.000 mg·mL-1，本研究選擇最常用的0.125 mg·mL-1作為供試品測試濃度，測定結果表明此樣品濃度溶解良好，且濾液放置后無沉淀現(xiàn)象。

2.2.3 精密度試驗 取龍膽提取物樣品(1號)約50 mg，精密稱定(52.68 mg)，以水400 mL溶解，過濾，分取5份(每份80 mL)進行電子舌測試，記錄測定結果并計算樣品測試的精密度。

2.2.4 樣品口感的電子舌測定對10批龍膽提取物供試品溶液，進行電子舌測定，記錄測試結果并進行數(shù)據(jù)分析。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 主成分分析(PCA)是從多個數(shù)值變量之間的相互關系入手，利用降維的思想，將多數(shù)變量轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)幾個互不相關的綜合變量的分析統(tǒng)計方法。通過盡可能的保留原有信息量來減少信息維數(shù)，用繁雜的多維數(shù)據(jù)建立有優(yōu)良可視性的2D/3D圖表，原始數(shù)據(jù)中最大量的信息將被投影在PC1軸，其次是PC2，PC3軸。每一個試樣將在PCA圖上形成一個集合，各試樣集合之間的距離常常用來表示它們之間的化學物質(zhì)或者味覺上的相似度。它具有不需要先驗知識，并找到一組新的數(shù)軸來最大限度的描述數(shù)據(jù)間的差異性，以此找尋最有用的信息，給出具有不同風味區(qū)域和簇的描述性圖表的優(yōu)點。

2.3 高效液相特征圖譜的分析

2.3.1 色譜條件 流動相：乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液洗脫，流速：0.7 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：285 nm；進樣量：10 μL。

2.3.2樣品的高效液相特征圖譜分析 取“2.1.1”項下制備的樣品溶液轉(zhuǎn)移至樣品瓶內(nèi)，進樣分析，記錄分析結果。

3 實驗結果

3.1 電子舌分析結果

3.1.1 精密度試驗結果 精密度實驗結果表明，7枚電極對樣品的響應值測定精密度良好，5份樣品的精密度實驗結果也符合要求(RSD < 2.0%)，測定結果見表1和圖2。

圖2 龍膽提取物10批樣品的電子舌測定PCA分布圖(n=3)

3.1.2 供試品測定結果 電子舌7枚電極對10批不同樣品的響應值見表2。

3.1.3 樣品的PCA測定結果 對7枚電極的測定結果進行PCA分析，10批龍膽提取物樣品的口感可以通過2個主成分PC1和PC2來進行表征，分別能代表80.997%和10.37%的電極測定信息。

樣品在結果的PCA圖上的分布情況見圖3。結果顯示，第6批樣品和第10批樣品與其余樣品距離較遠；第6批樣品和第10批樣品之間距離最遠，第4批樣品和第8批樣品之間距離最近。

PCA圖上樣品之間的相互距離見表3，樣品之間的相對距離遠近可以暗示其成分組成(口感)的差異大小。

3.1.4 電子舌數(shù)據(jù)聚類分析結果 9個不同產(chǎn)地10個龍膽藥材以主要成分分析獲得4個公共因子子使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件處理，采用組間聯(lián)接聚類方法，距離的計算方法為Euclidean distance，進行層次聚類分析，見圖3。

表1 龍膽提取物的電子舌測定精密度試驗結果

表2 龍膽提取物10批的電子舌測定結果

表3 10批個不同龍膽提取物樣品電子舌測定PCA圖上相互距離分布表

圖3 電子舌數(shù)據(jù)聚類分析

根據(jù)圖3結果顯示10個樣本共分為3 類，其中4號(吉林)，8號(通化)，7號(新賓)，9號(本溪)4個樣品聚為第一類；1號(云南，產(chǎn)于石家莊)，5號(安徽)，3號(黑龍江)3個樣品聚為第二類；2號(四川)，6號(云南，產(chǎn)于安國)2個樣品聚為第三類；10號(清原)單獨聚為第四類。

從圖3和表2可知，苦度較大的樣品聚在了第一類和第四類，由此可以判斷以上這兩類龍膽藥材味道較苦。

3.2 高效液相特征圖譜的分析結果

3.2.1 龍膽的高效液相色譜的結果

標準曲線(見圖4)

龍膽苦苷：Y=818.75X+111.72r=0.999 7

獐牙菜苦苷：Y=2 026.1X+2.913 2r=0.999 5

獐牙菜苷：Y=2 277.2X-0.599 7r=0.999 7

圖4 獐牙菜苷，龍膽苦苷，獐牙菜苦混合標準品HPLC色譜

圖5 龍膽樣品的HPLC色譜圖

3.2.2 不同產(chǎn)地龍膽三種有效成分的含量測定 高效液相色譜法測定出十種樣品中有效成分的含量見圖5。

3.2.3 高效液相數(shù)據(jù)聚類分析結果 9個不同產(chǎn)地10個龍膽藥材以主成分分析獲得的4個公共因子使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件處理，應用組間聯(lián)接聚類的方法，Euclidean distance距離的計算方法進行層次聚類結果的分析見圖6。

表4 不同產(chǎn)地的龍膽有效成分含量

圖6 液相數(shù)據(jù)聚類分析圖

結果顯示10個樣本共分為4類。其中5號(安徽)、10號(清原)、4號(吉林)、9號(本溪桓仁)4個樣品聚為第一類；7號(新賓)、8號(通化)2個樣品聚為第二類；2號(四川)、6號(云南，產(chǎn)于安國)2個樣品聚為第三類；1號(云南，產(chǎn)于石家莊)、3號(黑龍江)2個樣品聚為第四類。

從圖6和表4可知，質(zhì)量較好的樣品聚成了第二類，新賓和通化樣品均聚在這一類，由此可以得出以上兩產(chǎn)地的龍膽藥材質(zhì)量較優(yōu)且穩(wěn)定。

3.3 顯微鑒定藥材品種的結果

通過電子舌、高效液相和顯微鑒定的結果分析見表5總結可以看出新賓、通化和清原的龍膽都屬于龍膽(粗糙)，他們的味道最苦、質(zhì)量最好。

表5 各產(chǎn)地龍膽商品藥材顯微鑒定品種表

4 討論

以前電子舌廣泛的應用于食品領域的研究，但隨著醫(yī)藥領域的發(fā)展，基于電子舌對醫(yī)藥的研究也逐年增加。例如在藥品質(zhì)量監(jiān)控，在不同來源的藥物差異性對比，預估未知中藥提取物濃度和比較中草藥主成分的質(zhì)量優(yōu)劣等方面都有關聯(lián)[17]。并且電子舌能夠?qū)ξ兜肋M行客觀評價并把相關成分相互作用的內(nèi)在信息轉(zhuǎn)化成不同味道和質(zhì)量之間的關系，這使其在客觀表述和控制中草藥外觀氣味信息等方面有著廣泛的應用空間[18]，也使得中藥鑒定更加方便。

本研究采用電子舌技術，對不同產(chǎn)地來源的10批龍膽藥材，采用TS-5000Z電子舌系統(tǒng)自帶的DBMS數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，采用來自傳感器的原始數(shù)據(jù)進行味覺特征分析。對感官評價數(shù)據(jù)使用SPSS19.0系統(tǒng)進行主成分分析和聚類分析。采用HPLC法對龍膽藥材中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等活性成分進行含量測定研究?；诨疑P聯(lián)度分析法對龍膽藥材苦味與品質(zhì)的相關性進行分析。最后得到了新賓、通化和清源的龍膽都屬于粗糙龍膽，他們的味道最苦、質(zhì)量最優(yōu)的結果。

目前在傳統(tǒng)中草藥質(zhì)量評估中，人為感覺描述具有較強的主觀性，在量化標準、準確度和重復性方面的把握有欠缺，而且中草藥的成分極其繁雜，如果用傳統(tǒng)的光譜、色譜技術對成分進行定性定量，進而將定量化的指標對應到苦度計算，將會帶來非常繁雜和龐大的處理過程[19]。但利用電子舌分析系統(tǒng)對中藥成分進行區(qū)分，剛好能從混沌分析、整體預測的角度入手，可對樣品中成分定性和定量化分析的過程忽略，賦予樣品味道和電信號的整體信息。引入電子舌為中草藥的快速、便攜、準確、穩(wěn)定的篩選和產(chǎn)品化提供了良好的平臺[20]。本實驗的結果不但能降低人的感官對中藥味道判斷的模糊性和不準確性，提高中藥鑒別效率和準確度；而且可以初步建立以龍膽藥材的苦味來評價藥材質(zhì)量的方法，為中藥質(zhì)量評價提供了新的思路和方法。