藺翠翠，鄭懷東，劉學(xué)光，關(guān) 麗，聞福安，郭欣碩

（1.遼寧省水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測局，遼寧 沈陽 110000；2.沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧 沈陽 110000）

石油是含有多種物質(zhì)的復(fù)雜混合物，其中包括多種毒性大且具有“三致”效應(yīng)的有機(jī)物質(zhì)，如苯系化合物、多環(huán)芳烴（PHAs）等，因此它對生態(tài)環(huán)境具有極其嚴(yán)重的危害潛能，被許多國家納入危險物質(zhì)清單。美國國家環(huán)境保護(hù)局（USEPA）在1979年公布的129種優(yōu)先控制污染物名單中就己包含了16種PAHs。我國水中優(yōu)先控制的68種污染物黑名單中PAHs也在其列。石油通過各種途徑進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，對環(huán)境、植物、生物體乃至人類將產(chǎn)生持久性損害。酶是生物體用來維持機(jī)體正常新陳代謝的重要生物大分子，所有的生命活動都離不開酶的正常運行。酶活性被認(rèn)為是一種能夠快速而靈敏地反映環(huán)境脅迫對生物體影響的生化指標(biāo)。石油進(jìn)入生物體后，通過誘導(dǎo)可產(chǎn)生大量的ROS攻擊酶致使酶失活，同時還將與機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)直接發(fā)生作用，導(dǎo)致酶的表達(dá)和活性都發(fā)生變化。細(xì)胞中存在大型的抗氧化防御系統(tǒng)能夠及時清除ROS，抗氧化酶是清除ROS的第一道防線。

中華絨螯蟹廣泛分布于我國東部沿海、湖泊河流，是一重要的傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)蟹類。是我國出口優(yōu)勢水產(chǎn)品之一，其肉質(zhì)鮮美，是廣受喜愛的食用水產(chǎn)品。鰓是河蟹的呼吸器官，同時承擔(dān)著調(diào)節(jié)滲透壓和離子平衡的作用；肝胰腺是河蟹重要的解毒器官，在降低或消除外來有毒物質(zhì)毒害影響方面起著重要作用。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，石油在河蟹體內(nèi)的積累具有明顯的組織差異性，肝胰腺和腮的積累量較高，是急性毒性的主要靶點，并且能夠造成組織器官的顯微結(jié)構(gòu)變化。許多學(xué)者已將抗氧化酶作為生物體氧化脅迫的和損傷的標(biāo)志物，因此，本文就不同濃度的石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮組織細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）酶活性的影響進(jìn)行了研究，旨在探明石油對抗氧化酶系統(tǒng)的毒性影響程度與致毒機(jī)制，為水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗動物：中華絨螯蟹由盤錦光合蟹業(yè)有限公司提供，雌雄隨機(jī)，平均體重51.2±0.35克，實驗中飼養(yǎng)水采用鹽度為3‰的人工海水模擬生活環(huán)境。暫養(yǎng)5天后選擇大小適中、活力強的中華絨螯蟹作為實驗用蟹。

石油烴母液：1升燒杯中加入0號柴油和實驗用水，體積比約為1∶1，磁力攪拌器攪拌24小時，放置分層，虹吸下層溶液作為實驗用母液。

實驗儀器：電動勻漿機(jī)（IKA TIGITAL）、均質(zhì)器（IKA T10B）、雙光束紫外分光光度計（北京普析通用U V-1800）、低溫冷凍離心機(jī)（日本C F16R XⅡ）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（愛朗2000）、電子天平（Sartorius，BT25S）、低溫冷凍離心機(jī)（日本CF16RXⅡ）。

1.2 實驗設(shè)計

采用急性毒性實驗方法，由概率單位法計算得出石油對中華絨螯蟹的96小時半致死濃度（LD50）；根據(jù)LD50濃度設(shè)計3個實驗組，分別為低濃度組：6毫克/升、中濃度組：11毫克/升、高濃度組：22.5毫克/升，同時設(shè)對照組，每組設(shè)3個平行；隨機(jī)選取大小基本一致的15只中華絨螯蟹（雌雄分開）放入塑料養(yǎng)殖箱（42厘米×31厘米×26厘米），加入4升含有不同濃度受試物的養(yǎng)殖水，并用薄膜封口，以保證實驗組濃度恒定。染毒時間為96小時，實驗期間每天投喂成蟹飼料，下午投餌前吸凈殘餌，更換飼養(yǎng)用水，確保試驗組濃度穩(wěn)定，實驗期間及時清理死亡個體。

1.3 實驗方法

樣品處理：實驗結(jié)束后，各組隨機(jī)選取3只中華絨螯蟹，迅速解剖，取出肝胰腺和腮，先用預(yù)冷生理鹽水清洗、濾紙吸干表面水分，稱重后按重量（克）∶體積（毫升）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，玻璃勻漿器冰浴勻漿，勻漿液4℃勻漿10分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液-20℃保存，一周內(nèi)測定酶活性。

酶活測定：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活力測定具體操作步驟按照南京建成提供的試劑盒使用說明進(jìn)行操作，酶活性單位采用單位/毫克蛋白?？偟鞍诐舛炔捎肂radford法進(jìn)行測定，采用南京建成蛋白定量測試盒。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布性，單因素方差分析（ANOVA），Duncan法進(jìn)行多重比較，差異顯著臨界值為0.01。

2 結(jié)果

2.1 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活性影響見圖1。石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的SOD酶活的影響總體呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。肝胰腺對照組SOD酶活為84單位/毫克蛋白，低濃度組酶活為153單位/毫克蛋白，較對照組有顯著的升高（P＜0.01），中高濃度組酶活分別降至116和68單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01）。腮對照組酶活為149單位/毫克蛋白，酶活最高值為低濃度組的220單位/毫克蛋白，顯著高于對照組（P＜0.01），最低值為高濃度組的111單位/毫克蛋白，低于對照組的50%。

圖1 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD酶活性的影響

2.2 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮的CAT酶活性影響見圖2。石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活的影響呈現(xiàn)出低—高—低的變化趨勢，肝胰腺對照組CAT酶活為2.8單位/毫克蛋白，低濃度組酶活為2.2單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01），中濃度組酶活升至6.9單位/毫克蛋白，而高濃度處理CAT酶活又降至4.1單位/毫克蛋白。腮對照組CAT酶活為2.2單位/毫克蛋白，與肝胰腺CAT活力變化趨勢類似，腮CAT酶活性最高值出現(xiàn)在中濃度處理組為8.4單位/毫克蛋白，顯著高于對照組（P＜0.01）。最低值則出現(xiàn)在低濃度處理組為1.6單位/毫克蛋白。

圖2 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮CAT酶活性的影響

2.3 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮GST酶活性的影響

不同濃度石油對中華絨螯蟹的肝胰腺和腮GST酶活影響見圖3。石油對中華絨螯蟹肝胰腺GST酶活影響先降后升的變化趨勢，肝胰腺低濃度組酶活性為80單位/毫克蛋白，顯著低于對照組（P＜0.01），中、高濃度組肝胰腺酶活分別為117單位/毫克蛋白和132單位/毫克蛋白，與對照組差異極顯著（P＜0.01）。腮GST變化趨勢為低-高-低，GST酶活性最高值出現(xiàn)在中濃度組為196單位/毫克蛋白，而最低值則為高濃度組的132單位/毫克蛋白，均與對照組差異顯著（P＜0.01）。

圖3 石油對中華絨螯蟹肝胰腺和腮GST酶活的影響

3 討論

甲殼動物等無脊椎動物體內(nèi)缺乏特異性免疫機(jī)制，而主要依靠血細(xì)胞吞噬，作用抵御外界污染脅迫，血細(xì)胞在吞噬外援異物過程中會釋放活性氧。在正常條件下，生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡中，生理濃度的氧自由基不但不會危害生物體，反而能起到一些獨特的生理作用。對甲殼動物來說，它可以參與細(xì)胞的分裂生長、吞噬細(xì)胞的吞噬作用和受精膜的形成。但石油的存在將打破這種平衡，使甲殼動物產(chǎn)生大量氧自由基，造成對機(jī)體內(nèi)生物大分子如脂類、蛋白質(zhì)的氧化破壞，引起細(xì)胞損傷，從而使其喪失功能。甲殼動物清除體內(nèi)氧自由基主要通過抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）等多種活性酶完成。因此，抗氧化酶活性也是衡量機(jī)體過氧化程度的重要指標(biāo)，通過監(jiān)測這些指示性抗氧化酶的活力可以間接反映甲殼動物體內(nèi)氧自由基含量，顯示出機(jī)體受威脅程度。

SOD專一催化超氧陰離子，將之歧化為H2O2和O2，H2O2可被CAT和se-GPx進(jìn)一步分解為H2O和O2，從而阻止超氧陰離子轉(zhuǎn)化為活性更高的-OH。在本實驗研究中，低劑量組的SOD酶活表現(xiàn)出激活狀態(tài)，這與余群、張景飛等人的研究結(jié)果一致，分析這種激活由細(xì)胞內(nèi)氧自由基被石油大量誘導(dǎo)而產(chǎn)生。中高劑量組肝胰腺和腮的SOD活性被抑制，這與石油長期脅迫從而使中華絨螯蟹機(jī)體富集過多的氧自由基有關(guān)，過多的活性氧對中華絨螯蟹體內(nèi)的各種生物大分子，如脂類和蛋白質(zhì)等產(chǎn)生氧化性的破壞作用，從而引起細(xì)胞損傷，進(jìn)而使其喪失生理功能，對機(jī)體造成不可逆損傷。

CAT是一種含有Fe的金屬酶，能夠?qū)OD催化產(chǎn)生的H2O2分解為H2O和O2，當(dāng)受到較低濃度石油脅迫時，SOD活力的上升會導(dǎo)致體內(nèi)H2O2和羥自由基(-HO)含量的增加，如不及時清除，則會對機(jī)體造成更大的氧化損傷。此時，肝胰腺中CAT合成被激活，酶活性上升，起到了清除過量H2O2以保護(hù)機(jī)體的作用。本實驗表明，石油對中華絨螯蟹CAT活性的影響在低劑量抑制過后，中劑量表現(xiàn)出對CAT的激活作用，這與SOD、CAT在功能上的相關(guān)性有關(guān)，在中劑量組石油的長期脅迫下，中華絨螯蟹肝胰腺和腮SOD活力開始受到抑制，此時O-2的大量增加可誘導(dǎo)CAT活力的升高，從而消除機(jī)體的過氧化。

GST是一類多功能的解毒酶。特定的GST亞基對致癌性環(huán)氧化物和農(nóng)藥等異生物質(zhì)有特異的高催化活性，使之與GSH結(jié)合成低毒易排泄的化合物，屬機(jī)體11相代謝酶。同時GST也具有GPx活性，GST的多功能性使得它在機(jī)體的解毒代謝中有十分重要的作用。本實驗結(jié)果表明，低濃度組GST活力受到抑制，由于SOD活力的上升加快對氧自由基的清除，遏制了GST的活性。中高濃度組肝胰腺和腮的GST活力都被顯著誘導(dǎo)，表現(xiàn)出較強的敏感性和誘導(dǎo)性，即使腮高濃度組GST活力開始下降，但活力仍超過對照組，說明中華絨螯蟹GST在石油烴的解毒過程中有重要作用。而高濃度組腮GST活力的下降與脂質(zhì)過氧化和生物大分子損傷的持續(xù)增加有關(guān)，說明此時GST活性下降是自由基的毒性作用所致。GST活性下降的原因有可能是作為底物的GSH被大量消耗，同時解毒過程中產(chǎn)生的大量中間代謝物有可能改變GST亞基的組成降低GST活性。

4 結(jié)論

石油能夠影響中華絨螯蟹的抗氧化系統(tǒng)酶活性，酶活性的變化是中華絨螯蟹對石油危害的一種防御反應(yīng)。中華絨螯蟹抗氧化酶活性隨石油污染物脅迫的時間和濃度發(fā)生規(guī)律性變化，對SOD和GST酶活影響的規(guī)律是先升高再降低，對CAT酶活的影響規(guī)律為低—高—低。本實驗結(jié)果表明中華絨螯蟹的抗氧化系統(tǒng)對石油具有較高的敏感性，其抗氧化系統(tǒng)中SOD、CAT、GST等對解除石油造成的機(jī)體過氧化毒性方面具有重要作用。