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        離子色譜法測(cè)定水果中的有機(jī)酸

        2018-10-16 05:42:16,
        發(fā)酵科技通訊 2018年3期

        ,

        (杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測(cè)中心,浙江 杭州 311100)

        水果富含水分、糖分、纖維素、維生素和有機(jī)酸等,是公認(rèn)的健康食品.其中的各種有機(jī)酸不僅對(duì)水果的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)有著重要影響,而且部分有機(jī)酸還有著特殊的功效,如抗氧化、防腐和抑菌等[1].有機(jī)酸是三羧酸循環(huán)中的一個(gè)重要生化特征,水果采摘后,其新陳代謝過(guò)程依然在繼續(xù),并且不斷變化,因此,有機(jī)酸也是水果質(zhì)量的動(dòng)態(tài)判斷指標(biāo)[2].檢測(cè)有機(jī)酸的方法有很多,但各有局限.例如滴定法只適合測(cè)定總酸[3];酶學(xué)法適合測(cè)定某種特定有機(jī)酸[4];光譜法通常要進(jìn)行預(yù)衍生化、預(yù)分離等前處理,過(guò)程麻煩且能同時(shí)分離的有機(jī)酸種類少[5];由于有機(jī)酸沸點(diǎn)高,不易汽化,因此氣相色譜法準(zhǔn)確度欠佳等[6].

        高效液相色譜中的離子交換色譜法對(duì)有機(jī)酸的測(cè)定比較有優(yōu)勢(shì),準(zhǔn)確、快速、靈敏并能同時(shí)分離和測(cè)定多種離子[7].宋衛(wèi)得等利用梯度淋洗離子色譜法測(cè)定了白酒中26種有機(jī)酸和陰離子[8],呂洪風(fēng)利用離子色譜保留模型同時(shí)檢驗(yàn)果汁中7種有機(jī)酸,對(duì)3種不同的蘋果汁進(jìn)行分析,驗(yàn)證了該方法的精準(zhǔn)性和適用性[9],研究選擇西瓜、菠蘿和枇杷3種水果,應(yīng)用離子交換色譜法測(cè)定水果中的有機(jī)酸的變化規(guī)律,為水果質(zhì)量的鑒別提供依據(jù).

        1 實(shí)驗(yàn)儀器材料和方法

        1.1 原材料

        西瓜、菠蘿、枇杷,購(gòu)于杭州勾莊水果市場(chǎng).

        1.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(均為優(yōu)級(jí)純)

        乳酸[L(+)Lactic acid],SUPELCO,99%;草酸[Oxalic acid (Ethanedioic acid) ],Dr.Ehrenstorfer GmbH,99.5%;蘋果酸(DL-Malic acid),Dr.Ehrenstorfer GmbH,99.5%;檸檬酸(Citric acid monohydrate),Dr.Ehrenstorfer GmbH,99.5%;酒石酸(DL-Tartaric acid),Dr.Ehrenstorfer GmbH,99.5%.

        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

        ICS3000離子色譜儀,美國(guó)戴安公司;Y型精密電子天平,美國(guó)雙杰兄弟有限公司;PHILIPS打漿機(jī),廣州市奇明經(jīng)濟(jì)發(fā)展有限公司;TGL-16M高速立式冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HYJD超純水器,杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司;水相針式濾器(聚醚砜),0.22 μm,上海安譜科學(xué)儀器有限公司;一次性使用1 mL注射器(帶針),上??祲坩t(yī)療器械有限公司;1 000,200 μL移液槍,上海艾測(cè)電子科技有限公司.

        1.4 試驗(yàn)方法

        1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

        選擇成熟度相仿、大小相近、顆粒完整的枇杷,常溫條件陰涼處保存,每隔12 h取樣一次,每次取樣以5個(gè)為一組,從外觀上挑選成熟度接近的原料,每次取樣時(shí)都去除果皮,盡可能選擇果實(shí)的相同部位.

        選擇體積較大的西瓜、菠蘿各一個(gè),選取一圓周,取樣部位都在靠近果皮的一側(cè),每隔一天取樣一次,取樣后取樣部位用保鮮膜包裹,在常溫下保存,取樣和保存都在超凈臺(tái)上完成.

        1.4.2 樣品前處理

        每隔1 d,分別準(zhǔn)確稱取10 g左右西瓜、菠蘿、枇杷果肉.加90 mL去離子水,研磨,之后在4 ℃,13 000 r/min條件下,離心20 min,取上清液即為提取液.用移液槍移取提取液300 μL、去離子水1 200 μL于試劑瓶中,得到稀釋50倍的樣品溶液,再用0.22 μm的濾膜過(guò)濾后供離子色譜進(jìn)樣測(cè)試.

        1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

        用電子天平分別稱取檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、乳酸0.050 g,定容至50 mL容量瓶中,配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.分別用移液槍準(zhǔn)確移取檸檬酸液500 μL、蘋果酸液500 μL、酒石酸液500 μL、乳酸液500 μL和草酸液500 μL,并入100 mL容量瓶中,然后用超純水定容至刻度,從而得到檸檬酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、蘋果酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、酒石酸質(zhì)量濃度為5 mg/L、乳酸質(zhì)量濃度為5 mg/L和草酸質(zhì)量濃度為5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液.

        1.4.4 色譜條件

        抑制器膜:ASRS_4 mm;色譜柱:IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm;保護(hù)柱:IonPac AS11-HC 4 mm×50 mm;流動(dòng)相:KOH (淋洗液自動(dòng)發(fā)生器產(chǎn)生),進(jìn)行梯度測(cè)試,流速為1.0 mL/min;抑制電流為150 mA;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量為50 μL.

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜柱的選擇

        對(duì)比IonPac AS11 4 mm×250 mm和IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm兩種色譜柱的分離效果,可以發(fā)現(xiàn)兩者的離子交換功能基均為帶季銨鹽功能基的陰離子交換樹(shù)脂,對(duì)OH-的選擇性強(qiáng),親水性較強(qiáng).但是,IonPac AS11 4 mm×250 mm的柱容量很小,僅有45 μmol/柱;而IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱的柱容量較高,達(dá)到了270 μmol/柱,柱容量越大越有利于對(duì)乳酸、乙酸等一價(jià)有機(jī)酸的保留,色譜出峰時(shí)峰形越好,更有利于實(shí)現(xiàn)樣品中多組分的同時(shí)分離.另外一方面,通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比對(duì)弱組分的保留情況看,IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱對(duì)目標(biāo)化合物的分離效果好于IonPac AS11 4 mm×250 mm.所以本實(shí)驗(yàn)選用IonPacAS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱.

        2.2 流動(dòng)相與梯度的優(yōu)化

        離子交換色譜法分析有機(jī)酸常用稀堿溶液作淋洗液.因OH-為親水性離子,對(duì)固定相中的水合區(qū)有著天然的親水性,從而能夠有效地置換其他陰離子.常用氫氧化鈉或氫氧化鉀作淋洗液,因?yàn)镵+的當(dāng)量電導(dǎo)較低,所以本實(shí)驗(yàn)采用KOH作淋洗液.由淋洗液自動(dòng)發(fā)生器產(chǎn)生,保證了其高純度,避免雜質(zhì)的污染,濃度準(zhǔn)確,流速穩(wěn)定,平衡時(shí)間短,降低基線漂移,出峰平直、穩(wěn)定.

        實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫技術(shù),在分離過(guò)程中連續(xù)改變流動(dòng)相中的KOH濃度.分別采用0.6,0.8,1.2,1.6,2.0,10,20,30 mmol/L KOH淋洗液淋洗,發(fā)現(xiàn)淋洗液濃度為30 mmol/L時(shí),檸檬酸較易洗脫,淋洗液濃度為0.8 mmol/L時(shí),乳酸、草酸、酒石酸、蘋果酸能較易洗脫,得到尖銳峰形.經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)確定淋洗液KOH濃度梯度程序如表2所示.

        在該淋洗條件下,5種有機(jī)酸可實(shí)現(xiàn)基線分離,分離效果如圖1所示.

        表1 離子色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of ion chromatography

        圖1 5種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 The chromatogram of 5 kinds of mixed organic acid standard solution

        分別調(diào)節(jié)流速為0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8 mL/min,當(dāng)流速增大時(shí),分析時(shí)間明顯縮短,但當(dāng)流速大于1.0 mL/min時(shí),5種有機(jī)酸有機(jī)酸會(huì)與其中其他的雜質(zhì)峰所重疊,不利于出峰的形狀,當(dāng)流速小于1.0 mL/min時(shí),5種有機(jī)酸的出峰時(shí)間延長(zhǎng),但對(duì)5種有機(jī)酸的分離度影響并不大.因此,本實(shí)驗(yàn)選用1.0 mL/min的淋洗液流速.

        2.3 方法的線性范圍及檢出限

        根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)液出峰值的大小,分別取5種有機(jī)酸儲(chǔ)備液100 μL,稀釋定容于100 mL容量瓶中,配制成混合標(biāo)準(zhǔn)液.以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)X,峰面積為縱坐標(biāo)Y,進(jìn)行線性回歸.同時(shí),按3倍信噪比計(jì)算得出檢出限,5種有機(jī)酸的線性方程列于表2.對(duì)菠蘿進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),取兩份樣品,一份加標(biāo),一份對(duì)照,重復(fù)測(cè)定6次,進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn).

        由表2可知:該方法所得出的指標(biāo)中,選擇的離子色譜檢測(cè)體系對(duì)有機(jī)酸的檢測(cè)顯示了較高的靈敏度,檢出限較低,精密度好,被測(cè)組分的峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,且線性范圍寬,滿足所測(cè)3種水果中有機(jī)酸含量的變化特征的檢測(cè)要求.5種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為95%~100%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)均小于3.0%,該方法具有較好的穩(wěn)定性和回收率.

        表2 5種有機(jī)酸的線性范圍、檢出限和回收率Table 2 Linear range,detection limit and recovery rate of 5 kinds of organic acids

        2.4 樣品中的有機(jī)酸

        按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件,將處理好的樣品在梯度淋洗離子色譜中得到以下色譜圖,菠蘿樣品見(jiàn)圖2.

        圖2 菠蘿樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.2 Ionic chromatograms of organic acids in pineapple

        圖中常見(jiàn)的5種有機(jī)酸分離效果良好,圖2為菠蘿樣品的有機(jī)酸色譜圖.圖譜中共有10個(gè)峰,可以定性得出,菠蘿中的有機(jī)酸含有蘋果酸、檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸,圖譜中還有5個(gè)峰沒(méi)有定性,除了第2個(gè)未知峰之外,其他峰含量很小,分析可以得出菠蘿中主要有機(jī)酸為檸檬酸和蘋果酸,分別占總酸的67%,26%左右.

        由色譜圖的峰面積自動(dòng)計(jì)算得到菠蘿里5種有機(jī)酸含量,見(jiàn)表3.

        表3 菠蘿樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 The content of organic acids in pineapple

        圖3為枇杷樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖.

        圖3 枇杷樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.3 Ionic chromatograms of organic acids in loquat

        圖譜中共有9個(gè)峰,可以定性得出,枇杷中的有機(jī)酸含有乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸,其中最主要的是蘋果酸,其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸,占總酸的94%左右,其次為酒石酸和草酸.

        由色譜圖的峰面積自動(dòng)計(jì)算得到枇杷里5種有機(jī)酸含量,見(jiàn)表4.

        表4 枇杷樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 The content of organic acids in loquat

        圖4為西瓜樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖.

        圖譜中共有8個(gè)峰,可以定性得出,西瓜果實(shí)中含有的有機(jī)酸為乳酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和蘋果酸,其中最主要的是蘋果酸,其含量約占總酸的78.7%,其次是檸檬酸和酒石酸.

        由色譜圖的峰面積自動(dòng)計(jì)算得到枇杷里5種有機(jī)酸含量,見(jiàn)表5.

        圖4 西瓜樣品中有機(jī)酸的離子色譜圖Fig.4 Ionic chromatograms of organic acids in watermelon

        表5 西瓜樣品中有機(jī)酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 The content of organic acids in watermelon

        2.5 水果貯藏過(guò)程中有機(jī)酸的代謝

        有機(jī)酸是水果的一個(gè)標(biāo)志性特征成分,因采摘后的水果依然有新陳代謝,所以在水果儲(chǔ)藏期間有機(jī)酸含量是動(dòng)態(tài)變化的.而且不同水果變化狀況有所區(qū)別的,以下是儲(chǔ)存5 d的水果有機(jī)酸變化情況.

        2.5.1 菠 蘿

        在保證其他條件一致的前提下,將每天一次采集到的樣品進(jìn)行離子色譜測(cè)定,得到相應(yīng)時(shí)間段的結(jié)果見(jiàn)表6.

        表6 菠蘿果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化情況Table 6 Thecontentoforganic acids in pineapple during storage

        由表6可以可知:從含量上看檸檬酸和蘋果酸是菠蘿儲(chǔ)存代謝中的主要有機(jī)酸,其次為草酸和乳酸,酒石酸的含量最少.在5 d的儲(chǔ)藏期內(nèi),檸檬酸、蘋果酸和總酸都是呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),尤其是第5天相比第1天,總酸量高出近一倍,所以菠蘿儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)酸澀味越強(qiáng)甜度越低也就顯而易見(jiàn)了.草酸、乳酸和酒石酸在5 d的時(shí)間內(nèi),相對(duì)來(lái)說(shuō)變化不是很大,對(duì)菠蘿口感影響較小.雖然也有其他相關(guān)資料報(bào)道菠蘿在貯藏過(guò)程中檸檬酸和總酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),但是與本實(shí)驗(yàn)并不矛盾,因本實(shí)驗(yàn)儲(chǔ)存時(shí)間短,只有5 d.之所以這樣考慮,是因?yàn)樽鳛樗称?,新鮮度十分重要,如果儲(chǔ)存過(guò)長(zhǎng)時(shí)間,就會(huì)導(dǎo)致水果的腐爛變味甚至無(wú)法食用.

        2.5.2 枇 杷

        與菠蘿相比枇杷更易腐爛,所以在48 h之內(nèi)完成5次采樣,離子色譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7.

        表7 枇杷果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 7 The content of organic acids in loquat during storage

        由表7可以看出:枇杷中蘋果酸最多,占總酸94%左右,檸檬酸、草酸、乳酸和酒石酸含量較少.在前36 h蘋果酸和總酸含量呈上升趨勢(shì),48 h的數(shù)據(jù)顯示檸檬酸、蘋果酸和總酸含量都在下降,草酸、乳酸和酒石酸略微上升的.這也解釋了為什么枇杷采摘后隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越淡而無(wú)味.另外隨著枇杷果實(shí)的衰老與腐爛的開(kāi)始,酸的下降速度加劇,所以如果常溫保存,一般在36 h內(nèi)最好食用完,否則品質(zhì)會(huì)急劇下降.

        2.5.3 西 瓜

        可能因?yàn)槲鞴现杏袡C(jī)酸含量少,測(cè)定難度稍大,關(guān)于西瓜中有機(jī)酸含量的測(cè)定鮮有報(bào)道,未見(jiàn)用離子色譜法測(cè)定西瓜中的有機(jī)酸,本實(shí)驗(yàn)對(duì)此作了探索.西瓜采樣方法與菠蘿相同,表8是離子色譜法測(cè)定的結(jié)果.

        表8 西瓜果實(shí)貯藏期間有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 8 The content of organic acids in watermelon during storage

        由表8可以看出:西瓜中蘋果酸和檸檬酸最多,分別占總酸的73%左右和20%左右,而草酸、乳酸和酒石酸較少.在前3天蘋果酸、檸檬酸和總酸含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì),第4天數(shù)據(jù)顯示檸檬酸和總酸在下降,蘋果酸和乳酸卻有上升.可能西瓜在前3天單純處于果實(shí)后熟階段,之后品質(zhì)開(kāi)始下降,并伴隨著檸檬酸的大量消耗.可見(jiàn),新鮮西瓜在常溫下放置的時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng),一般放置2 d左右西瓜風(fēng)味較好.

        3 結(jié) 論

        實(shí)驗(yàn)建立了離子交換色譜法測(cè)定菠蘿、枇杷、西瓜中5種有機(jī)酸含量的方法.3種水果中含有多種有機(jī)酸,但經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)中樣品處理、色譜柱的選擇、梯度淋洗等方法,使得常見(jiàn)有機(jī)酸的極性和離解的難易程度與所測(cè)定的5種有機(jī)酸差異很大,所以對(duì)5種有機(jī)酸的測(cè)定基本沒(méi)有影響.實(shí)驗(yàn)證明,選用IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm色譜柱,分別在0.8,30 mmol/L KOH淋洗液條件下以1.0 mL/min的流速進(jìn)行離子色譜法測(cè)定5種有機(jī)酸的方法,樣品前處理簡(jiǎn)單,操作方法簡(jiǎn)便、快捷,線性范圍寬,分析結(jié)果可靠,應(yīng)用范圍廣.3種果實(shí)采摘后,其中的有機(jī)酸的積累仍然沒(méi)有停止,在貯藏過(guò)程中,枇杷和西瓜果實(shí)中的有機(jī)酸含量都是先增加后降低,主要是檸檬酸的代謝而消耗,菠蘿果實(shí)中的有機(jī)酸含量一直在遞增,說(shuō)明菠蘿果實(shí)的取樣時(shí)間太短,菠蘿果實(shí)還處于后熟的過(guò)程,有機(jī)酸的代謝速度慢.3種水果果實(shí)中的有機(jī)酸含量分別為菠蘿>枇杷>西瓜,說(shuō)明菠蘿的風(fēng)味主要由有機(jī)酸組成,而西瓜的風(fēng)味則主要由果實(shí)中的糖類構(gòu)成,3種果實(shí)的貯存時(shí)間長(zhǎng)短分別為菠蘿>西瓜>枇杷.

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