王桂青，姚 紅，吳嘉誠(chéng)，MUHAMMAD Anwar，曾黎輝

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002)

中國(guó)水仙(Narcissustazettavar．chinensis)是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，是一類(lèi)觀賞價(jià)值極高的經(jīng)濟(jì)植物[1-2]。然而水仙花色單調(diào)、品種單一，制約著水仙產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展?；伾男纬芍饕怯深?lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素和生物堿三類(lèi)物質(zhì)決定。其中，屬于類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)的花青素(anthocyanin)為天然水溶性色素, 決定絕大多數(shù)植物的花色, 可以使花朵呈現(xiàn)出紅、粉、藍(lán)和紫等顏色[3-4]。類(lèi)黃酮代謝還有原花青素代謝、黃酮醇代謝等其他代謝分支途徑，黃酮醇途徑中黃酮醇能和花青素共同作用使植物呈現(xiàn)豐富多彩的顏色[5]。中國(guó)水仙花色以黃白色為主，主要原因是缺乏花青素[6]。植物中很多調(diào)控黃酮類(lèi)次生代謝的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括編碼MYB、MYC、bZIP 蛋白、WD40蛋白和鋅指蛋白等基因家族[7]。MYB基因家族廣泛存在于植物中，高等植物中絕大多數(shù)的MYB基因都屬于R2R3-MYB，它們廣泛參與植物次生代謝調(diào)控，并對(duì)細(xì)胞分化、植物形態(tài)建成及抗病具有重要的調(diào)節(jié)作用[8-16]。R2R3類(lèi)MYB轉(zhuǎn)錄因子在類(lèi)黃酮代謝途徑產(chǎn)生色素的次生代謝過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[17]，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)與類(lèi)黃酮代謝途徑中某些關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子中的重要順式作用元件結(jié)合，從而調(diào)控類(lèi)黃酮生物合成途徑中一個(gè)或多個(gè)酶基因的表達(dá)，有效地調(diào)節(jié)類(lèi)黃酮生物合成途徑[7]。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的共同特征是在其N(xiāo)端都具有一段高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域[18]，在C端有一個(gè)激活或抑制的結(jié)構(gòu)域[19]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的類(lèi)黃酮代謝途徑R2R3-MYB激活因子有葡萄中的VvMYB1[20]、草莓中的FaMYB10[21]以及擬南芥中的AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113等[22]。調(diào)控類(lèi)黃酮合成的MYB基因，并非全都是正向調(diào)控作用，有些起負(fù)調(diào)控作用，抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，如擬南芥中的AtMYB3、AtMYB4、AtMYB7、AtMYB32等[23]以及棉花中的GhMYBL2[24]等，都是抑制因子，它們通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；草莓中的FaMYB1也是抑制因子，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)MBW復(fù)合體中其他MYB蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，以此抑制花青素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[25-26]；此外，擬南芥中發(fā)現(xiàn)的R2R3-MYB蛋白AtMYBL2能直接與MBW復(fù)合體中的關(guān)鍵bHLH蛋白TT8結(jié)合形成復(fù)合體，進(jìn)而抑制花青素的合成[27-28]。Xu等[29]在銀杏(Ginkgobiloba)中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)黃酮合成的負(fù)調(diào)控MYB蛋白GbMYBF2，并通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥證實(shí)了它的功能。然而在單子葉植物中，對(duì)類(lèi)黃酮合成起負(fù)調(diào)控作用的MYB基因研究相對(duì)較少。

本實(shí)驗(yàn)從水仙鱗莖盤(pán)轉(zhuǎn)錄組中篩選得到一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，命名為NtMYB7。用RT-PCR技術(shù)克隆該基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行序列分析，熒光定量PCR檢測(cè)該基因在水仙不同部位不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)以及利用煙草瞬時(shí)表達(dá)對(duì)基因功能進(jìn)行初步研究。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解NtMYB7基因的功能奠定基礎(chǔ)，而且有助于進(jìn)一步探究中國(guó)水仙不能合成花青素的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材 料

以漳州水仙‘金盞銀臺(tái)’為試驗(yàn)材料，分別采集中國(guó)水仙成花過(guò)程不同時(shí)期的花瓣和副冠，以及鱗莖盤(pán)、葉片，用液氮速凍，立即放入-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)以普通煙草(Nicotianatabacum)為實(shí)驗(yàn)材料，將普通煙草種子播種于土中，待其生長(zhǎng)出4片真葉后用于后續(xù)試驗(yàn)。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于Thermo公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit。

1.2 方 法

1.2.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成參照RNA提取試劑盒的方法，提取中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)’總RNA。利用紫外分光光度計(jì)Q-5000檢測(cè)RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA條帶的完整性和清晰度；按照ReverAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA的第一條鏈，放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2PCR引物的設(shè)計(jì)與合成利用DNAMAN設(shè)計(jì)引物(表1)，引物合成及基因測(cè)序工作均委托由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3NtMYB7基因cDNA的克隆以鱗莖盤(pán)cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Ex-Taq緩沖液 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，Ex-Taq(5 U /μL)0.2μL，加水至終體積25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段的回收按照Omega膠回收試劑盒的操作流程進(jìn)行,并按照全式金pEASY-T1 Simple Cloning Kit說(shuō)明連接至pEASY-T1載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析基因的分子特征分析主要采用生物信息學(xué)方法，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)和蛋白質(zhì)翻譯；利用Blastn和Blastx(http://blast.ncbi.nlm.Nih,gov/Blast.c)進(jìn)行核苷酸及蛋白質(zhì)同源性搜素；利用MEGA7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5NtMYB7在中國(guó)水仙花不同發(fā)育階段和不同部位的表達(dá)以中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)’Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，熒光定量PCR研究NtMYB7在鱗莖盤(pán)、葉片以及3個(gè)發(fā)育時(shí)期的花瓣和副冠(花苞期、始花期和盛花期)的表達(dá)，引物見(jiàn)表1，在羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行。將合成的cDNA(500 ng/μL)稀釋10倍作為模板，反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 6.4 μL，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。PCR反應(yīng)程序采用兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)(PCR反應(yīng)過(guò)程)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min(熔解曲線分析過(guò)程)。根據(jù)熒光定量PCR目的基因NtMYB7和內(nèi)參基因Actin的Ct值，利用2-ΔΔCt方法[30]對(duì)NtMYB7基因在不同發(fā)育階段和不同部位相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,利用q檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析。

1.2.6NtMYB7基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建采用In-Fusion方法構(gòu)建載體，按照In-Fusion HD Cloing Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。首先按要求設(shè)計(jì)新的引物(表1)，PCR擴(kuò)增NtMYB7目的基因，以pSAK277為表達(dá)載體，通過(guò)EcoRI和HindⅢ雙酶切及連接反應(yīng)，正向接入到表達(dá)載體中。將重組載體pSAK277-NtMYB7導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中。完成載體構(gòu)建后，挑取陽(yáng)性克隆菌落，采用菌液PCR檢測(cè)以及雙酶切鑒定，最后送生物公司測(cè)序，驗(yàn)證載體是否構(gòu)建成功。

1.2.7煙草瞬時(shí)表達(dá)及定量分析首先將甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)劉玉匯博士贈(zèng)送的花青素R2R3-MYB激活因子StMYB以及StbHLH的表達(dá)載體pSAK277-StMYB、pSAK277-StbHLH[31]以及對(duì)照質(zhì)粒pBI121(含有GUS基因)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。分別挑取農(nóng)桿菌菌落于YEB培養(yǎng)基中，搖菌過(guò)夜至OD600為0.6～0.8。將菌液分別置于50 mL離心管中，4 000 r·min-1離心5 min，再用重懸緩沖液(10 mmol/L MES,150 μmol/L AS, 10 mmol/L MgCl2)重懸調(diào)至OD600為0.6，靜置3 h。按照1∶1比例混合不同質(zhì)粒后，用注射器分別注射煙草葉片：1)單獨(dú)注射StMYB；2)StMYB+pBI121；3)單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB7；4)StMYB+NtMYB7；5)StMYB+NtMYB7+StBHLH。每個(gè)處理重復(fù)3次。

將注射后的煙草放入培養(yǎng)室中，經(jīng)過(guò)4～5 d后觀察葉片顏色變化，同時(shí)提取煙草注射部位以及未注射正常煙草的葉片RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)煙草類(lèi)黃酮代謝途徑中PAL(phenylalanine ammonia lyase)、4CL(4-coumarate:CoA ligase)、CHS(chalcone synthase)、CHI(chalcone isomerase)、F3H(flavonoid 3-hydroxylase)、F3′H(flavonoid 3′-hydroxylase)、FLS(flavonol synthase)、DFR(dihydroflavonol 4-reductase)、LAR(Leucoanthocyanidin reductase)、ANS(anthocyanidin sythase)、ANR(anthocyanidin reductase)、UFGT(UDP-glucose-flavonoid3-o-glucosyltransferase)等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)情況,引物見(jiàn)表2。

表1 引物及其序列

注：下劃線表示同源片段

Note: The horizontal lines indicate the homologous fragment

表2 煙草熒光定量PCR所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 NtMYB7基因的克隆和序列分析

特異性引物RT-PCR擴(kuò)增NtMYB7 cDNA編碼全長(zhǎng)序列,得到與預(yù)期基因片段大小一致的條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為753 bp，編碼250個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)MF522208。

2.2 NtMYB7基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

DNAMAN分析比對(duì)結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白存在明顯的R2和R3保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB蛋白。 經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與NCBI上已登錄的多種植物R2R3-MYB基因編碼蛋白相似性較高，其中與蘆筍Myb4-like、油棕Myb4-like、海棗Myb4-like和香蕉亞種Myb4相似性分別為57%、57%、54%和53%。通過(guò)MEGA7.0軟件，將NtMYB7蛋白與其他物種MYB基因編碼蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，NtMYB7與AtMYB3等MYB4-like花青素合成抑制因子聚在一起(圖3)。進(jìn)化樹(shù)中花青素合成激活因子單獨(dú)聚為一類(lèi)；花青素合成抑制因子分成3類(lèi)，其中R2R3-MYB有MYB4-like和FaMYB1-like兩個(gè)亞類(lèi)，R3-MYB抑制因子與其他MYB基因編碼蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 NtMYB7在中國(guó)水仙花不同發(fā)育階段和不同部位的表達(dá)

M. DL2000；1. NtMYB7擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 NtMYB7基因的克隆M. DL2000；1. PCR products of NtMYB7 geneFig.1 Cloning of NtMYB7 from Chinese narcissus

熒光定量PCR結(jié)果顯示，NtMYB7的表達(dá)水平在不同的部位不同，鱗莖盤(pán)中表達(dá)量最高，表達(dá)量是花苞期花瓣表達(dá)量的近20倍。在花瓣中，NtMYB7基因的相對(duì)表達(dá)量隨著水仙花的開(kāi)放逐漸升高，盛花期達(dá)到最高；在副冠中，始花期表達(dá)量最高，花苞期和盛花期表達(dá)量較低(圖4)。

2.4 煙草瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

將NtMYB7構(gòu)建植物表達(dá)載體，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR鑒定、雙酶切瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序分析均顯示載體構(gòu)建成功(圖5)。

NtMYB7注射煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究。如圖6，單獨(dú)注射花青素激活因子StMYB的煙草葉片明顯呈現(xiàn)深紅色；對(duì)照帶有GUS基因的pBI121與StMYB混合注射葉片也呈現(xiàn)深紅色，與單獨(dú)注射StMYB差別不大；單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB7部位煙草葉片無(wú)反應(yīng)，呈現(xiàn)淺綠色；將NtMYB7與StMYB混合注射葉片呈現(xiàn)淡紅色；注射StMYB+NtMYB7+StbHLH三個(gè)基因混合物的葉片也呈現(xiàn)淡紅色，但比NtMYB7與StMYB混合注射顏色略深。

NtMYB7. 水仙；AtMYB4. 擬南芥；AtMYB32. 擬南芥；AmMYB308. 金魚(yú)草；PhMYB4. 矮牽牛；VvMYB4A. 葡萄；BrMYB4. 甘藍(lán)型油菜；GhMYB4. 棉花；FaMYB1. 草莓圖2 NtMYB7與R2R3-MYB氨基酸序列的多重序列比對(duì)NtMYB7. Narcissus tazetta var．chinensis；AtMYB4. Arabidopsis thaliana；AtMYB32. Arabidopsis thaliana；AmMYB308. Antirrhinum；PhMYB4. Petunia hybrida；VvMYB4A. Vitis vinifera；BrMYB4. Brassica rapa subsp. rapa；GhMYB4. Gossypium hirsutum；FaMYB1. Fragaria ananassa；Fig.2 Multiple alignment of the NtMYB7 with other R2R3-MYB proteins

2.5 煙草葉片中結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的瞬時(shí)檢測(cè)

煙草葉片中結(jié)構(gòu)基因瞬時(shí)表達(dá)的定量PCR結(jié)果(圖7)顯示，單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB7的葉片中，PAL、4CL的表達(dá)顯著上調(diào)；FLS的表達(dá)量顯著下調(diào)，對(duì)照未注射的煙草葉片中FLS的表達(dá)量是注射N(xiāo)tMYB7葉片的近14倍；NtMYB7還抑制CHS、CHI、F3H、F3′H、ANR和UFGT的表達(dá)；由于煙草中DFR、LAR、ANS的表達(dá)量太低，不能判斷出NtMYB7是否抑制這幾個(gè)基因的表達(dá)(圖7)。

圖3 NtMYB7與類(lèi)黃酮相關(guān)MYB因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of NtMYB7 and other flavonoid related MYBs

1P. 花苞期花瓣；2P. 始花期花瓣；3P. 盛花期花瓣；1C. 花苞期副冠：2C. 始花期副冠；3C. 盛花期副冠；L. 葉片；B. 鱗莖盤(pán)；不同小寫(xiě)字母表示組織間差異顯著(P<0.05)圖4 NtMYB7基因在水仙中不同發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)1P. Petals of budding stage；2P. Petals of early flowering stage；3P. Petals of full-bloom stage；1C. Coronas of budding stage；2C. Coronas of early flowering stage；3C. Coronas of full-bloom stage；L. Leaf；B. Basal plate；The different normal letters indicate significant differences among organs (P<0.05)Fig.4 Relative expression of NtMYB7 gene at different development stages and organs in Chinese narcissus

除FLS和ANR外，煙草中類(lèi)黃酮生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、LAR、ANS、ANR和UFGT的表達(dá)都被StMYB誘導(dǎo)顯著上調(diào)(圖8)；在StMYB和NtMYB7混合注射的葉片中，除PAL和4CL外，被StMYB誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量都顯著下調(diào)，說(shuō)明NtMYB7抑制這些基因的表達(dá)；StMYB、NtMYB7和StBHLH三者混合注射葉片中，與StMYB和NtMYB7混合注射葉片中一樣，煙草CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、LAR、ANS和UFGT的表達(dá)量都下降(圖8)。

M1. DL2000；1～3. 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；4. 重組質(zhì)粒；M2. DL15000圖5 重組質(zhì)粒pSAK277-NtMYB7雙酶切鑒定M1. DL2000；1-3. Enzyme digestion products of recombinant plasmid；4. Recombinant plasmid；M2. DL15000Fig.5 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pSAK277-NtMYB7

R1～R3. 3個(gè)重復(fù)；a.StMYB；b.StMYB+pBI121；c.NtMYB7；d.StMYB+NtMYB7；e.StMYB+NtMYB7+StBHLH；0～9.不同色塊表示注射不同基因后的顏色差異圖6 NtMYB7煙草瞬時(shí)表達(dá)R1-R3. 3 repetitions；a.StMYB；b.StMYB+pBI121；c.NtMYB7；d.StMYB+NtMYB7；e.StMYB+NtMYB7+StBHLH；0-9. Different color-blocks indicate the color difference after different gene injectionFig.6 Transient expression analysis of NtMYB7 in tobacco

WT. 野生型(未注射的煙草葉片)；NtMYB7. 單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB7的煙草葉片；PAL.苯丙氨酸解氨酶；4CL.輔酶a連接酶；CHS.查耳酮合酶；CHI.查耳酮異構(gòu)酶；F3H.類(lèi)黃酮3；F3′H.類(lèi)黃酮3′；FLS.黃酮醇合酶；DFR.二氫黃酮醇4-還原酶；LAR.無(wú)色花色素還原酶；ANS.花青素合成酶；ANR.花青素還原酶；UFGT.類(lèi)黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶。下同圖7 瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)WT. Wild type(Non-injected tobacco leaf)；NtMYB7. Separate injection NtMYB7；PAL.Phenylalanine ammonia lyase；4CL.4-coumarate CoA ligase；CHS.Chalcone synthase；CHI.Chalcone isomerase；F3H.Flavonoid 3-hydroxylase；F3′H.Flavonoid 3′-hydroxylase；FLS.Flavonol synthase；DFR.Dihydroflavonol 4-reductase；LAR.Leucoanthocyanidin reductase；ANS.Anthocyanidin sythase；ANR.anthocyanidin reductase, UFGT.UDP-glucose-flavonoid3-o-glucosyltransferase. The same as below.Fig.7 Expression analysis of structural genes in transient expression leaves of tobacco

3 討 論

擬南芥中R2R3-MYB基因根據(jù)保守元件的不同被分為22個(gè)不同的亞族，其中擬南芥S4亞家族、S5亞家族、S6亞家族、S7亞家族基因參與花青素和類(lèi)黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[32-35]。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，NtMYB7同擬南芥S4家族中的AtMYB3、AtMYB4有較高的相似性[36]，屬于R2R3-MYB抑制基因中MYB4-like類(lèi)，表明NtMYB7的基因功能可能與MYB4-like類(lèi)抑制因子相似，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用,使類(lèi)黃酮生物合成途徑的某些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)受阻。

WT.野生型(未注射的煙草葉片)；StMYB. 單獨(dú)注射StMYB的煙草葉片；StMYB+NtMYB7. 注射StMYB+NtMYB7的煙草葉片； StMYB+NtMYB7+StBHLH. 注射StMYB+NtMYB7+StBHLH的煙草葉片;不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)圖8 瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)WT. Wild type(Non-injected tobacco leaf)；StMYB. Separate injection StMYB；StMYB+NtMYB7. Injection StMYB+NtMYB7；StMYB+NtMYB7+StBHLH. Injection StMYB+NtMYB7+StBHLH；The normal letters indicate significant differences among treatments (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of structural genes in transient expression leaves of tobacco

瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，花青素激活因子StMYB誘導(dǎo)煙草葉片生成花青素的作用被NtMYB7抑制，證明了NtMYB7是花青素合成的抑制因子，但是抑制效果較弱；單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB7葉片中FLS的表達(dá)被顯著抑制，說(shuō)明NtMYB7可能抑制黃酮醇代謝分支途徑；在StMYB和NtMYB7混合注射的葉片中，原花青素代謝途徑的關(guān)鍵基因LAR和ANR的表達(dá)量也下降，說(shuō)明NtMYB7也會(huì)抑制原花青素代謝途徑。因此，NtMYB7可能同時(shí)抑制類(lèi)黃酮代謝途徑不同分支的代謝，是類(lèi)黃酮合成途徑的抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)，從白色智利草莓(Fragariachiloensis)中分離出的FaMYB1的同源蛋白FcMYB1可能通過(guò)下調(diào)表達(dá)ANS，上調(diào)表達(dá)原花青素合成關(guān)鍵基因ANR和LAR來(lái)決定該草莓果實(shí)的無(wú)色表型[37]。銀杏(Ginkgobiloba)中發(fā)現(xiàn)的MYB4-like類(lèi)轉(zhuǎn)錄抑制因子GbMYBF2在擬南芥中的過(guò)表達(dá)能顯著抑制花青素及黃酮類(lèi)物質(zhì)的生成，并且類(lèi)黃酮合成途徑中的CHS、F3H、FLS、ANS等結(jié)構(gòu)基因表達(dá)均受到抑制[38]。單子葉植物花青素合成抑制因子的報(bào)道較少，瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示NtMYB7可以抑制類(lèi)黃酮合成途徑的大部分基因。

FaMYB1、GbMYBF2等R2R3-MYB蛋白均含有保守的抑制基序pdLNLD/ELxiG/S，相關(guān)研究表明擁有保守抑制基序的蛋白，其作用機(jī)制主要為主動(dòng)抑制[39]。還有一些特殊的R2R3-MYB因子，不含EAR抑制基序，但在某些特定條件下也能抑制花青素的積累。如擬南芥AtMYB60，在萵苣(Lactucasativa)中過(guò)表達(dá)該基因時(shí)，轉(zhuǎn)化植株由野生型紅葉表型變?yōu)榫G葉表型，相應(yīng)的DFR表達(dá)也下調(diào)[40]。蘋(píng)果MdMYB6也沒(méi)有保守抑制域，在高濃度蔗糖處理?xiàng)l件下MdMYB6能使大部分結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)下調(diào)，抑制花青素的積累[41]。序列分析表明NtMYB7不含pdLNLD/ELxiG/S保守抑制基序，這可能與其抑制效果較弱有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。在瞬時(shí)表達(dá)中，向NtMYB7+StMYB混合液中加入StBHLH進(jìn)行注射，顏色有所加深。NtMYB7的抑制作用是通過(guò)直接抑制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)或者與激活因子競(jìng)爭(zhēng)bHLH有待進(jìn)一步研究。

熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，NtMYB7基因在水仙不同器官中的表達(dá)量分析表明，NtMYB7在鱗莖盤(pán)中表達(dá)量最高。中國(guó)水仙鱗莖盤(pán)中的黃酮類(lèi)物質(zhì)主要是原花青素，花中的黃酮類(lèi)物質(zhì)主要是黃酮醇[6]，NtMYB7有可能在鱗莖盤(pán)中主要抑制黃酮醇和花青素的合成，而在花瓣和副冠中主要抑制花青素和原花青素的合成，但這個(gè)推測(cè)有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。