高源，王昆，王大江，趙繼榮，張彩霞，叢佩華，劉立軍，李連文，樸繼成

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7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析

高源，王昆，王大江，趙繼榮，張彩霞，叢佩華，劉立軍，李連文，樸繼成

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城 125100）

【目的】利用熒光SSR分子標(biāo)記，對(duì)新收集的7個(gè)來(lái)源地區(qū)的山荊子種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，明確群體內(nèi)和群體間的遺傳多樣性和結(jié)構(gòu)，為蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的收集保存和種的遺傳進(jìn)化研究提供依據(jù)?！痉椒ā亢Y選19對(duì)多態(tài)性好的SSR引物檢測(cè)7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子的多態(tài)性，利用GenAlEx 6.501計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)、分析群體間的分子變異（AMOVA），利用GenepopV4和Fstat293分析群體間的遺傳分化，基于Nei遺傳距離，利用POPULATION 1.2構(gòu)建269份材料的Neighbour-Joining（NJ）進(jìn)化樹(shù)，使用STRUCTURE 2.3.4進(jìn)行貝葉斯聚類(lèi)并分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)?！窘Y(jié)果】19對(duì)SSR引物共檢測(cè)出392個(gè)多態(tài)性等位基因，平均等位基因數(shù)20.6，平均有效等位基因數(shù)9.070，觀察雜合度和期望雜合度的平均值分別為0.628和0.855，香農(nóng)多樣性指數(shù)為2.392。按照來(lái)源地區(qū)劃分群體，以黑龍江群體的觀測(cè)等位基因數(shù)最多為15.684，俄羅斯群體的遺傳多樣性最低，河北群體的遺傳多樣性最高。兩兩群體間遺傳分化系數(shù)為0.019—0.111，河北與多個(gè)地域的群體基因交流頻繁，甘肅群體是7個(gè)群體中最為穩(wěn)定的，群體間的遺傳分化和基因交流與地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)?；贜ei遺傳距離的聚類(lèi)分析在遺傳距離0.7444處將269份材料可以分成7個(gè)類(lèi)群，多數(shù)類(lèi)群與地理位置不相關(guān)。其中類(lèi)群Ⅰ和Ⅱ與其他類(lèi)群遺傳距離較遠(yuǎn)，類(lèi)群Ⅱ和Ⅲ的聚類(lèi)比較混雜，類(lèi)群Ⅵ的材料來(lái)源最為復(fù)雜，類(lèi)群Ⅳ和Ⅴ相對(duì)比較單純，類(lèi)群Ⅶ中99%為黑龍江山荊子。群體結(jié)構(gòu)分析將269份材料劃分成了3個(gè)類(lèi)群，具有3個(gè)可能的基因來(lái)源，不同來(lái)源地的材料在各群體中均有分布，與地理位置沒(méi)有十分明確的相關(guān)性。只有黑龍江、山西和甘肅群體以及部分俄羅斯和河北材料的類(lèi)群歸屬相對(duì)單一，與聚類(lèi)有相似的結(jié)果。269份材料中Q≥0.6有232份，大部分山荊子的血緣相對(duì)單一。【結(jié)論】19對(duì)SSR引物具有高度的多態(tài)性，可以作為有效的標(biāo)記用于山荊子群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)。7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子遺傳多樣性均較高，以河北地區(qū)的遺傳多樣性最高，遺傳變異和分化主要發(fā)生在群體內(nèi)和個(gè)體內(nèi)部；群體間有基因交流，以河北與其他地區(qū)的交流最頻繁；抵制基因漂變而導(dǎo)致的群體間的遺傳分化，群體間的遺傳分化程度和基因交流水平與地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)。

山荊子；熒光SSR；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】山荊子（( L.) Borkh.）屬薔薇科（Rosaceae）蘋(píng)果屬（Mill.）[1]，是蘋(píng)果屬植物中分布最廣，變異更為多樣的類(lèi)群[2]。山荊子花果美麗、樹(shù)形優(yōu)雅，常被用作砧木和園林綠化樹(shù)種，果實(shí)、種子、幼葉及木材均有很高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，是蘋(píng)果屬植物中較為珍貴的野生資源。具有豐富變異的蘋(píng)果屬野生種是蘋(píng)果砧木選育和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)和必要前提。通過(guò)蘋(píng)果屬植物的考察和收集，增加蘋(píng)果屬優(yōu)異種的特異類(lèi)型，并開(kāi)展新收集蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)的評(píng)價(jià)，對(duì)明確收集保存蘋(píng)果屬植物的遺傳多樣性水平，指導(dǎo)其保護(hù)和有效利用具有重要意義，為研究種的遺傳進(jìn)化提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】山荊子主要分布于中國(guó)的東北、華北及西南，包括遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、河北、山西、山東、陜西、甘肅、四川、云南、貴州及西藏；朝鮮及西伯利亞亦有分布[3-6]。山荊子原產(chǎn)于亞洲東北部，在長(zhǎng)期演變和進(jìn)化過(guò)程中形成了豐富的變異類(lèi)型[2]。通過(guò)其表型和不同居群遺傳多樣性研究表明，其居群間的遺傳分化和親緣關(guān)系較為復(fù)雜[7-10]。探明不同來(lái)源區(qū)域山荊子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)是闡明其種群親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化的重要途徑。山荊子的形態(tài)變異式樣已經(jīng)得到了充分的研究[11-12]，利用RAPD[9]、ISSR[13]和SSR[14]分子標(biāo)記僅對(duì)少數(shù)居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究。其中，王雷宏等[14]僅利用10對(duì)SSR引物對(duì)河北塞罕壩、山西靈空山、山西管涔山、山西中條山、山西五臺(tái)山、黑龍江小興安嶺以及北京東靈山8個(gè)山荊子居群140個(gè)單株的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，推測(cè)山荊子起源于中國(guó)華北和東北地區(qū)，山西靈空山、黑龍江小興安嶺、吉林長(zhǎng)白山以及山西中條山居群可能為遺傳多樣性的核心居群。平均每個(gè)居群不到20個(gè)個(gè)體，且有4個(gè)居群來(lái)自于山西，因此，有必要通過(guò)利用多態(tài)性更高、數(shù)量更多的SSR引物以及更先進(jìn)的檢測(cè)和數(shù)據(jù)方法對(duì)更廣泛來(lái)源的山荊子群體進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以往對(duì)于山荊子的遺傳多樣性研究主要注重于其表型，利用分子標(biāo)記的方法僅對(duì)少數(shù)居群進(jìn)行過(guò)研究，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)均采用的凝膠電泳。熒光SSR分子標(biāo)記是將SSR分子標(biāo)記和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，利用測(cè)序儀進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，具有效率高、準(zhǔn)確度和靈敏度好、避免人工判讀條帶的誤差等優(yōu)點(diǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城梨、蘋(píng)果圃自2008年至2015年分別對(duì)黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、山西、甘肅和河北等中國(guó)野生蘋(píng)果資源的主要分布區(qū)以及俄羅斯的西伯利亞地區(qū)進(jìn)行蘋(píng)果種質(zhì)資源的考察和收集，并實(shí)現(xiàn)入圃安全保存?；谝呀?jīng)廣泛收集的山荊子種質(zhì)資源，利用熒光SSR分子標(biāo)記的方法，以研究蘋(píng)果屬山荊子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究篩選19對(duì)高效的SSR引物，對(duì)新收集的7個(gè)來(lái)源地區(qū)的269份山荊子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，明確已收集區(qū)域該種的遺傳多樣性水平和遺傳變異，以期為該種的進(jìn)一步有效收集和保護(hù)、起源和地理演化規(guī)律研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試每份種質(zhì)均為2008年至2015年蘋(píng)果資源的原生境考察過(guò)程中，在野外通過(guò)表型鑒定為山荊子本種之后，采集其野生群落的特異類(lèi)型種質(zhì)接穗，引入國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城梨、蘋(píng)果圃?xún)?nèi)無(wú)性繁殖，待鑒定評(píng)價(jià)后給予國(guó)圃號(hào)。于2016年春季采集嫩葉并進(jìn)行試驗(yàn)，2017年完成所有材料的SSR分子標(biāo)記鑒定，所有供試山荊子材料信息見(jiàn)電子附表1。其中MB26—MB37和MB130—MB148保存于國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)公主嶺寒地果樹(shù)圃（吉林省公主嶺），其余供試山荊子材料保存于國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)興城梨、蘋(píng)果圃（遼寧省興城）。269份山荊子材料包括來(lái)源于俄羅斯37份、黑龍江92份、吉林19份、內(nèi)蒙古44份、河北58份、山西15份和甘肅4份。

1.2 試驗(yàn)方法

采用德國(guó)QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取供試材料春季嫩葉的基因組DNA。從Hokanson等[15]、Liebhard等[16]、Yamamoto等[17]和Guilford等[18]報(bào)道的序列中選取擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度在100—300 bp并經(jīng)檢測(cè)具有高度多態(tài)性的SSR引物19對(duì)，除GD15和NH015a在蘋(píng)果染色體上的位置未知外，其余17對(duì)SSR引物均來(lái)源于編碼區(qū)并分別定位于10條染色體上[17,19-20]，19對(duì)引物所屬染色體連鎖群、引物名稱(chēng)編號(hào)和序列見(jiàn)電子附表2。其中，NH009b、NH015a和NZ28f4SSR為梨SSR引物，NH015a定位于梨的第17染色體上。SSR反向引物和5’端帶有6FAMTM熒光標(biāo)記SSR正向引物由上海生工有限公司合成。

PCR體系參照Cao等[21]，擴(kuò)增產(chǎn)物的純化體系參照高源等[22]方法。PCR反應(yīng)在Bio-Rad PTC-200上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增并經(jīng)過(guò)純化后的SSR熒光標(biāo)記產(chǎn)物在美國(guó)ABI 3730基因測(cè)序儀上進(jìn)行熒光檢測(cè)，收集原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GeneMapper3.0軟件對(duì)ABI3730收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得不同樣品在每個(gè)SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。利用遺傳數(shù)據(jù)分析軟件GenAlEx 6.501[23-24]計(jì)算多態(tài)性等位基因數(shù)（）、SSR 位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（）、觀察雜合度（）、期望雜合度（）、固定指數(shù)（）及香農(nóng)多樣性指數(shù)（）等遺傳多樣性指標(biāo)，并分析群體間的分子變異（AMOVA）。利用GenepopV4和Fstat293[25-26]計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)和群體遺傳多樣性、群體內(nèi)遺傳多樣性、群體間的遺傳多樣性、遺傳分化系數(shù)和基因流?；贜ei遺傳距離[27]，利用POPULATION 1.2構(gòu)建269份山荊子材料的Neighbour-Joining（NJ）進(jìn)化樹(shù)，并用在線(xiàn)繪圖軟件iTOL（Interactive tree of life）[28]繪制。使用STRUCTURE 2.3.4進(jìn)行貝葉斯聚類(lèi)[29]，分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)并確定最佳的群體分組。首先設(shè)定等位變異頻率特征數(shù)（遺傳群體數(shù)）K=1—5，設(shè)定Burn-in周期為100 000，MCMC的重復(fù)次數(shù)為100 000次，采用混合模型和相關(guān)等位基因頻率，對(duì)不同的K值進(jìn)行10次重復(fù)運(yùn)行，然后將后綴為“_f”的結(jié)果文件壓縮，上傳到“STRUCTURE HARVESTER”網(wǎng)站（http://taylor0.biology.ucla.edu/ struct_harvest/），據(jù)Evanno等[30]的方法計(jì)算得到Delta K和似然值的對(duì)數(shù)函數(shù)Lnp（D），分別針對(duì)基因庫(kù)數(shù)目（K）建模，確定最佳K值。利用CLUMPP 1.1.2軟件[31]處理10次獨(dú)立運(yùn)行得到的分配系數(shù)Q值（即每一個(gè)類(lèi)群內(nèi)每個(gè)個(gè)體之間的估測(cè)系數(shù)），然后使用DISTRUCT 1.1軟件[32]將計(jì)算結(jié)果進(jìn)行圖形化輸出。

2 結(jié)果

2.1 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

19對(duì)具有明顯多態(tài)性的SSR引物對(duì)269份山荊子材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出392個(gè)多態(tài)性等位基因（），多態(tài)性等位基因數(shù)為13（NZ28f4）—32（CH01d08），平均等位基因數(shù)為20.6（表1）。每份樣品在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生2個(gè)相同（單峰）或不同（雙峰）的等位基因。有效等位基因數(shù)（）為2.343（NZ28f4）—16.334（CH01d08），平均值為9.070。觀察雜合度（）為0.476—0.859，平均值為0.628。期望雜合度（）為0.573—0.939，平均期望雜合度為0.855。香農(nóng)多樣性指數(shù)（）為1.307—3.044，平均值為2.392。而固定指數(shù)（）只有在NZ28f4中為負(fù)值，其余均為正值，說(shuō)明供試山荊子群體內(nèi)含有的雜合子較少。

表1 不同SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性特征

2.2 7個(gè)山荊子群體的遺傳多樣性

將所有山荊子材料按照來(lái)源地區(qū)劃分為7個(gè)群體（表2），黑龍江群體的觀測(cè)等位基因數(shù)最多為15.684；河北群體的有效等位基因數(shù)和香農(nóng)指數(shù)最高，分別為8.218和2.278；全部群體的雜合度均高于0.5，俄羅斯群體的觀察雜合度最高為0.725；河北群體的期望雜合度最高為0.852；期望雜合度與觀察雜合度差值最小的為俄羅斯群體，差值最大的為河北群體；固定指數(shù)在各個(gè)群體均為正值，其中在俄羅斯群體中最小為0.126，相比于其他群體其雜合子較多。

2.3 群體間的遺傳分化和分子變異

為了揭示各個(gè)收集區(qū)域山荊子群體的遺傳差異，按照來(lái)源地劃分群體后計(jì)算Nei遺傳距離（表3）。可以看出，甘肅與吉林群體間遺傳距離最大為1.061，除山西群體外，甘肅與俄羅斯、黑龍江、內(nèi)蒙古和河北群體的遺傳距離均較大；吉林與內(nèi)蒙古群體間的遺傳距離最小為0.193，除甘肅外，吉林與其他5個(gè)來(lái)源地山荊子的遺傳距離均相對(duì)較小。甘肅與其他來(lái)源地群體的遺傳距離總和最大，其次是俄羅斯群體，最小的為河北群體。從一定程度上體現(xiàn)了群體間地理距離與遺傳距離的相關(guān)性。

表2 7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子群體的遺傳多樣性

表3 7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子群體間遺傳距離和遺傳分化系數(shù)

對(duì)角線(xiàn)下方的值為群體間遺傳分化系數(shù)（），對(duì)角線(xiàn)上方的值為群體間Nei遺傳距離

The data below the diagonal is, and above the diagonal is Nei genetic distance

群體發(fā)生分化主要是基因型或基因型頻率不同，因此，基于SSR基因型鑒定，推測(cè)山荊子的基因分化。如表4所示，所有供試山荊子在種水平的基因多樣性為0.868，群體內(nèi)遺傳多樣性為0.831，群體間遺傳多樣性為0.037，居群間基因分化系數(shù)為0.049，基因流為5.785。對(duì)7個(gè)群體進(jìn)行群體分子遺傳變異方差分析，遺傳結(jié)構(gòu)分類(lèi)群的遺傳變異極顯著（＜0.001），群體內(nèi)方差分量的貢獻(xiàn)率占23%，而群體間方差分量的貢獻(xiàn)率僅占4%，個(gè)體內(nèi)方差分量的貢獻(xiàn)率占73%。山荊子基因分化和分子遺傳變異2個(gè)系數(shù)指標(biāo)分析結(jié)果一致，說(shuō)明山荊子整體遺傳多樣性較高，但其主要分布在群體內(nèi)部和由個(gè)體差異產(chǎn)生的遺傳變異，群體間分布較低的遺傳多樣性。

7個(gè)山荊子群體基因流平均值為5.785，根據(jù)公式=0.25（1-）/，計(jì)算群體間遺傳分化系數(shù)為0.0414，即7個(gè)群體間的遺傳變異為4.14%，與群體分子遺傳變異方差分析（AMOVA）中群體間方差分量的貢獻(xiàn)率相一致；而群體內(nèi)的遺傳變異為95.84%，表明各個(gè)群體在過(guò)去的某個(gè)時(shí)間相互都可能曾發(fā)生過(guò)基因交流，但同時(shí)這又抵制了由于基因漂變而導(dǎo)致的群體遺傳分化。7個(gè)群體兩兩間遺傳分化系數(shù)為0.019—0.111，河北與吉林群體間的遺傳分化系數(shù)最低為0.019，而甘肅與內(nèi)蒙古群體間的遺傳分化系數(shù)最高為0.111。俄羅斯群體作為國(guó)外的群體，也是供試地理位置最北端的群體，其與甘肅群體的遺傳分化系數(shù)最高為0.073，其次是與內(nèi)蒙古群體，而與河北群體的遺傳分化系數(shù)最低。群體間遺傳分化系數(shù)與其地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)。

表4 基于SSR標(biāo)記的7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子群體的分子方差分析（AMOVA）和基因分化

2.4 基于Nei遺傳距離的聚類(lèi)分析

基于所有山荊子材料的SSR數(shù)據(jù)的Nei遺傳距離進(jìn)行NJ聚類(lèi)。在遺傳距離0.7444處，269份材料可以分成7個(gè)類(lèi)群（圖1）。其中類(lèi)群Ⅰ和Ⅱ與其他類(lèi)群遺傳距離較遠(yuǎn)，類(lèi)群Ⅰ遺傳多樣性豐富，包含來(lái)自黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古和河北的19份材料；類(lèi)群Ⅱ主要為內(nèi)蒙古的12份和河北的19份材料，以及9份吉林和3份黑龍江材料。類(lèi)群Ⅲ包含4份俄羅斯、10份內(nèi)蒙古、6份山西、1份吉林和1份河北材料；類(lèi)群Ⅳ主要為河北的22份和俄羅斯的27份材料，以及1份黑龍江、2份山西和4份吉林材料；類(lèi)群Ⅴ主要包含內(nèi)蒙古的14份、黑龍江的2份和河北的2份材料；類(lèi)群Ⅵ的40份材料來(lái)自供試的全部7個(gè)來(lái)源地，材料來(lái)源最為復(fù)雜，相互交錯(cuò)在一起；類(lèi)群Ⅶ中除1份河北材料，其余全部為來(lái)自于黑龍江。

黑色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅰ，紫紅色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅱ，橘色分支線(xiàn)為類(lèi)群體Ⅲ，藍(lán)色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅳ，紫色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅴ，綠色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅵ，紅色分支線(xiàn)為類(lèi)群Ⅶ

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)對(duì)269份山荊子材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置分析群體數(shù)K為1—10，重復(fù)10次。根據(jù)得到的結(jié)果（圖2-A），隨著K值的增加，Lnp（D）一直上升，無(wú)明顯的拐點(diǎn)。因此，根據(jù)Evanno等[30]的方法，用△K來(lái)確定K值，當(dāng)K=3時(shí)，△K取得最大值（圖2-B）。所以，可以將269份材料劃分為3個(gè)群體，具有3個(gè)可能的基因來(lái)源，不同來(lái)源地的材料在群體中均有分布（圖3）。黑龍江、甘肅和山西的材料與其他區(qū)域分化明顯，內(nèi)蒙古材料在區(qū)域內(nèi)部有明顯分化；河北和俄羅斯的材料群體區(qū)域內(nèi)分化亦明顯，基因來(lái)源相似。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與SSR聚類(lèi)結(jié)果一致。

根據(jù)計(jì)算出來(lái)的各個(gè)群體中的Q值分布，當(dāng)某一材料在某群體中的Q≥0.6時(shí)，認(rèn)為該材料血緣比較單一，Q＜0.6則認(rèn)為該材料擁有混合來(lái)源[33]。本研究有232份材料Q≥0.6，說(shuō)明大部分山荊子的血緣相對(duì)單一；擁有混合來(lái)源的材料僅占13.75%。在Q≥0.6的232份材料中，包含的俄羅斯材料屬于類(lèi)群2（紅色）和類(lèi)群3（藍(lán)色）的數(shù)量分別為25份和6份，黑龍江材料屬于類(lèi)群1（綠色）和類(lèi)群3的數(shù)量分別為73份和6份，吉林材料分屬于3個(gè)類(lèi)群的數(shù)量分別為9份、5份和3份，內(nèi)蒙古材料屬于類(lèi)群1和類(lèi)群3的數(shù)量分別為25份和15份，河北材料分屬于3個(gè)類(lèi)群的數(shù)量分別為6份、10份和30份，山西材料除1份屬于類(lèi)群1外，其余12份屬于類(lèi)群3，甘肅材料全部屬于類(lèi)群3。

3 討論

3.1 山荊子的遺傳多樣性

本研究利用19對(duì)SSR引物，對(duì)7個(gè)來(lái)源地區(qū)的269份野生山荊子種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，19個(gè)SSR位點(diǎn)除2個(gè)位點(diǎn)在染色體上的位置未知外，其余17對(duì)SSR引物定位于10條染色體上，全部為多態(tài)位點(diǎn)，在群體中多態(tài)位點(diǎn)的百分率為100%。表明這19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均具有高度的多態(tài)性，雖未全部覆蓋所有的染色體，但在種群間可轉(zhuǎn)移性高，可作為有效的遺傳標(biāo)記用于山荊子遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。

Delta K 和似然值的對(duì)數(shù)函數(shù)LnP(D)根據(jù)Evanno等[30]的方法計(jì)算得到，分別針對(duì)基因庫(kù)數(shù)目（K）建模

RU：俄羅斯；HLJ：中國(guó)黑龍江；JL：中國(guó)吉林；NMG：中國(guó)內(nèi)蒙古；HB：中國(guó)河北；SX：中國(guó)山西；GS：中國(guó)甘肅?？v坐標(biāo)為Q值（每一個(gè)類(lèi)群內(nèi)每個(gè)個(gè)體之間的估測(cè)系數(shù)）0.00—1.00，橫坐標(biāo)為7個(gè)來(lái)源地區(qū)群體代碼，7個(gè)群體間用黑線(xiàn)分隔

觀測(cè)等位基因數(shù)（）是衡量SSR位點(diǎn)多態(tài)性和群體變異程度高低的重要指標(biāo)。19對(duì)SSR引物在7個(gè)群體269份材料中共擴(kuò)增出392個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增20.6個(gè)（=20.6），遠(yuǎn)高于前人利用SSR標(biāo)記對(duì)三葉海棠[34]、刺梨[35]、豆梨[36]和櫻桃[37]等野生果樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行研究的結(jié)果。

平均有效等位基因數(shù)（）、平均Shannon 信息指數(shù)（）、平均期望雜合度（）等是評(píng)價(jià)遺傳多樣性的重要指標(biāo)。本研究表明7個(gè)來(lái)源地的269份山荊子的遺傳多樣性（=0.855，=2.392，=9.070）高于以往研究的三葉海棠[34]（）（=0.699，=1.458，=3.954）、湖北海棠[38]（）（=0.2628，=0.4015，=1.4375）、變?nèi)~海棠[39]（）（=0.4389，=0.6282，=1.81）和新疆野蘋(píng)果[40]（）（= 0.2619，= 0.4082，=1.4252），也高于前人研究山荊子遺傳多樣性（）（=0.3386，=0.4961，=1.6021）[9]、（=0.5285，=1.6169）[14]，與蘋(píng)果屬野生種[41]（=0.86，=2.07）的遺傳多樣性相接近。相較于蘋(píng)果屬其他植物而言，供試7個(gè)山荊子群體的遺傳多樣性處于較高水平，充分證明了其是蘋(píng)果屬變異更為多樣的類(lèi)群[2]。推測(cè)原因，其一是本研究中的山荊子材料來(lái)源廣泛，地域跨度大，從華北、西北到東北，而且包含了國(guó)外種質(zhì)資源考察收集的種質(zhì)；其二是收集材料中大多來(lái)自于山荊子原生境野生分布群落，有的成片分布、有的零散分布，未經(jīng)過(guò)較多的人為干預(yù)；其三可能是由于蘋(píng)果屬植物種間幾乎不存在生殖隔離，極易發(fā)生屬內(nèi)種間自然雜交，導(dǎo)致種間基因互滲。但究其遺傳多樣性高的深入原因，是否真的與種間基因互滲有關(guān)，還需要通過(guò)根據(jù)山荊子來(lái)源區(qū)域探究與其地理位置相近的蘋(píng)果屬各種間的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證明。

在以往的對(duì)野生蘋(píng)果種質(zhì)資源的考察收集過(guò)程中，在幾乎所有的考察區(qū)域均可收集山荊子本種的不同類(lèi)型，這也充分證明了其是蘋(píng)果屬中分布最廣的種[2]。對(duì)蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的考察和收集要盡可能多的涉及到其原生境分布區(qū)域，在生產(chǎn)和人為干預(yù)之前搶救性收集蘋(píng)果野生資源并實(shí)現(xiàn)其安全保存，仍然是較快提高國(guó)家蘋(píng)果種質(zhì)資源圃蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平的重要方式。

3.2 7個(gè)群體的遺傳多樣性

對(duì)按照來(lái)源地劃分的7個(gè)群體進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)山荊子群體的遺傳多樣性水平均處于較高的水平。一般認(rèn)為雜合度高于0.5的種群沒(méi)有經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度的人工選擇，具有較高的遺傳多樣性[42]，本研究中7個(gè)群體雜合度均高于0.5，均未經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度的人工選擇，遺傳多樣性相對(duì)較高。相比而言，黑龍江群體的觀測(cè)等位基因數(shù)最多，而河北群體的有效等位基因數(shù)和香農(nóng)指數(shù)最高，這表明河北群體可能比黑龍江群體存在更豐富的稀有基因，遺傳多樣性也比黑龍江群體更高。根據(jù)雜合度的意義，雜合度觀測(cè)值和雜合度期望值的相近程度也可以衡量群體的遺傳多樣性，它們的值越接近，群體遺傳多樣性越高[42]。期望雜合度與觀察雜合度差值最小的為俄羅斯群體，差值最大的為河北群體，因此，根據(jù)固定系數(shù)雖然俄羅斯群體中比其他群體含有較多的雜合子，但河北群體的遺傳多樣性最高。群體間的遺傳多樣性比較可以指導(dǎo)蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的收集，本研究中7個(gè)區(qū)域遺傳多樣性水平均較高，但黑龍江和河北地區(qū)可以作為山荊子的優(yōu)先收集區(qū)域考慮。

3.3 群體間的遺傳分化

估算群體間的遺傳分化系數(shù)可區(qū)分群體間和群體內(nèi)相對(duì)遺傳變異大小，是解釋群體遺傳變異程度的主要依據(jù)[43-44]。WRIGHT[45]認(rèn)為，若群體值為0—0.05，則表明其各亞群間不存在分化；若值為0.05—0.15，為中度分化；若值在0.15—0.25，則為高度分化。本研究?jī)蓛扇后w間遺傳分化系數(shù)為0.019—0.111，其中黑龍江與俄羅斯群體、內(nèi)蒙古與俄羅斯群體、甘肅與俄羅斯群體、甘肅與黑龍江群體、甘肅與吉林群體、甘肅與內(nèi)蒙古群體、甘肅與河北群體發(fā)生中度分化，其余兩兩群體間均未發(fā)生分化，群體間的遺傳分化與地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)。根據(jù)基因流與遺傳分化系數(shù)的計(jì)算公式可知，每代遷入的有效個(gè)體數(shù)與群體間遺傳差異水平成反比，群體越穩(wěn)定，度量群體間遺傳差異程度的值越大，反之當(dāng)值比較低時(shí)，則對(duì)應(yīng)的群體基因穩(wěn)定性越差，基因交流越頻繁[40]。本試驗(yàn)中河北與吉林群體的值最低，河北與山西群體的值次之，河北與俄羅斯群體的值再次之。充分說(shuō)明了河北群體與多個(gè)地域的群體基因交流頻繁，甘肅群體是7個(gè)群體中最為穩(wěn)定的，群體間的基因交流與地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)，但基因交流的同時(shí)又抵制了由于基因漂變而導(dǎo)致的群體間的遺傳分化。山荊子常被用作實(shí)生砧木，隨苗木調(diào)運(yùn)長(zhǎng)距離運(yùn)輸，由此造成種質(zhì)交流頻繁。本次供試山荊子材料雖均來(lái)自于野生群落，但有的群落為成片分布，有的為零星分散分布，尤其是河北地區(qū)收集到的山荊子材料，其中有少部分材料來(lái)源于生產(chǎn)園周邊的半山坡上，河北地區(qū)蘋(píng)果栽培歷史悠久，是蘋(píng)果主要產(chǎn)區(qū)之一，因此，究其歷史不排除收集的野生山荊子基因來(lái)源于其他地區(qū)的可能。而黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、甘肅和山西材料均完全來(lái)自于山區(qū)、林區(qū)或自然保護(hù)區(qū)等純野生環(huán)境。這也許可以解釋為何河北群體與多個(gè)地域的群體基因交流頻繁。

3.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)

群體遺傳結(jié)構(gòu)是群體內(nèi)各個(gè)亞群的分布情況，同時(shí)也反映了亞群的結(jié)構(gòu)特征。利用STRUCTURE軟件分析群體結(jié)構(gòu)是基于不同個(gè)體中等位基因出現(xiàn)的頻率，通過(guò)計(jì)算Q值（第份材料SSR位點(diǎn)變異源于第K群體的概率）而歸類(lèi)。所有供試山荊子材料可以分為3個(gè)類(lèi)群，有3個(gè)可能的基因來(lái)源，與地理位置沒(méi)有十分明確的相關(guān)性，只有黑龍江、山西和甘肅群體以及部分的俄羅斯和河北材料類(lèi)群歸屬相對(duì)單一，這與Nei遺傳距離的NJ聚類(lèi)結(jié)果相一致；諸多地理位置相近的種質(zhì)也未聚到一起，這與王雷宏等[14]的研究結(jié)果相一致。按照Wright[45]的理論和王雷宏等[14]對(duì)山荊子的研究，山荊子群體相對(duì)穩(wěn)定，不存在遺傳漂變，但分化程度較高。通過(guò)本試驗(yàn)研究，山荊子群體的遺傳變異和分化主要存在于群體內(nèi)部和個(gè)體內(nèi)部，抵制基因漂變產(chǎn)生群體間遺傳分化。本研究群體遺傳結(jié)構(gòu)分析對(duì)指導(dǎo)蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源的進(jìn)一步考察和收集具有重要的意義，并為后續(xù)研究蘋(píng)果屬植物的進(jìn)化提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

19對(duì)SSR引物具有高度的多態(tài)性，可以作為有效的標(biāo)記用于山荊子群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)。7個(gè)來(lái)源地區(qū)山荊子遺傳多樣性均較高，以河北地區(qū)的遺傳多樣性最高，遺傳變異和分化主要發(fā)生在群體內(nèi)和個(gè)體內(nèi)部；群體間有基因交流，以河北與其他地區(qū)的交流最頻繁；抵制基因漂變而導(dǎo)致的群體間的遺傳分化，群體間的遺傳分化程度和基因交流水平與地理位置遠(yuǎn)近不完全相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 李莉）

The Genetic Diversity and Population Structure Analysis on(L.) Borkh from 7 Sources

GAO Yuan, WANG Kun, WANG DaJiang, Zhao JiRong, ZHANG CaiXia, CONG PeiHua, LIU LiJun, LI LianWen, PIAO JiCheng

(Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Crops Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】Genetic diversity and population structure offrom 7 newly collected sources were analyzed using fluorescent SSR molecular markers. The identification of genetic diversity and structure within and among populations can provide references for germplasm collection and preservation of Malus and the study of the phylogenetic evolution of species. 【Method】19 pairs of polymorphic SSR primers were screened to detect the polymorphism offrom 7 sources. GenAlEx 6.501 was used to calculate the index of genetic diversity and analyze the molecular variation (AMOVA) among populations. The genetic differentiation among populations were analyzed by GenepopV4 and Fstat293. Based on the Nei genetic distance, the Neighbour-Joining (NJ) evolutionary tree of 269 accessions was constructed using POPULATION 1.2. The Bayesian cluster was carried out using STRUCTURE 2.3.4 to analyze the genetic structure of populations.【Result】392 polymorphic alleles were detected by 19 pairs of SSR primers, with an average allele number of 20.6 and effective allele number of 9.070. The average values of heterozygosity and expected heterozygosity were 0.628 and 0.855 respectively, and the Shannon index was 2.392. Dividing populations according to their sources, the highest number of observed alleles in Heilongjiangpopulation was 15.684. The genetic diversity in Russian population was the lowest, and the highest genetic diversity was in Hebei population. The coefficient of genetic differentiationbetween every two populations was from 0.019 to 0.111. The gene of Hebei population communicate frequently with other populations, andGansu population was the most stable among 7 populations. The genetic differentiation and gene exchange among populations were not completely related to the geographical location far or near. The cluster analysis based on Nei genetic distance could divided 269 accessions into 7 groups at 0.7444. Most of groups were not related to geographical location, among which group Ⅰ and Ⅱ were far away from other groups, and the cluster of groupⅡ and Ⅲ was mixed, the sources of group Ⅵ was the most complex, groupⅣ and Ⅴ were relatively pure, and finally 99% of all accessions in group Ⅶ were from Heilongjiang. The population structure analysis divided 269 accessions into 3 groups with 3 possible genetic sources. The accessions from different sources were distributed into every group, and there was no clear correlation with the geographical location. Only most part ofHeilongjiang, Shanxi and Gansu population, as well as some of accessions from Russia and Hebei belonged to a relatively simple group. This result was similar to the results of clustering. In 269 accessions, the Q value of 232 accessions were higher than 0.6, and most of them had relatively single genetic background. 【Conclusion】19 pairs of SSR primers were highly polymorphic and could be used for the evaluation of genetic diversity and population structure. The genetic diversity offrom 7 regions was high with the highest genetic diversity of thosefrom Hebei, and genetic variation mainly occured within populations and individuals. There was genetic communication among populations with the most frequent communication between Hebei and other groups, but at the same time, it also resisted genetic differentiation among populations caused by gene drift. Genetic differentiation and gene exchange among populations were not completely related to geographical location.

; fluorescent SSR; genetic diversity; population structure

2018-04-25；

2018-05-15

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2016-RIP-02）、農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-27）、農(nóng)作物種質(zhì)資源保護(hù)（NB2015-2130135-39）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303093）

高源，E-mail：gaoyuan02@caas.cn。 通信作者叢佩華，E-mail：congph@163.com。通信作者王昆，E-mail：wangkun5488@163.com