魏沙沙，邱小鳳，蔡雪玲，孫威江1,，陳志丹*

(1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學安溪茶學院，福建 泉州 362400；3．福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心，福建 泉州 362400；4.福建省茶產(chǎn)業(yè)技術開發(fā)基地，福建 泉州 362400)

TCP轉錄因子家族在玉米TB1、金魚草CYC和水稻PCF中最早發(fā)現(xiàn)，取首字母(TB1-CYC-PCF)進行縮寫，得到名稱TCP。TCP轉錄因子是一類植物特有的轉錄因子，其特征是擁有一個由60個氨基酸組成的高度保守的TCP結構域，此結構域是一個非典型的bHLH(堿性-螺旋-環(huán)-螺旋)結構域，廣泛參與了植物生長發(fā)育的特定階段連同部分生理生化反應的過程，如參與調控葉、花型和側枝的生長發(fā)育，這些在擬南芥[1-3]、玉米[4]、水稻[5]、棉花[6-7]、蘋果[8]、黃瓜[9]、葡萄[10]、西瓜[11]、矮牽牛[12-13]等的研究中已被發(fā)現(xiàn)。在對TCP2、TCP3、TCP4、TCP11、TCP16、TCP24等的研究中發(fā)現(xiàn)，TCP家族的功能在各成員內(nèi)普遍存在著相似性[14-17]。根據(jù)TCP結構域的序列特點，分成Class I和Class II兩個亞家族。又因TCP結構域的差異，Class II可以被細分為CIN支和CYC/TB1分支[18]。相關研究顯示，TCP4基因在細胞分化環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要控制作用，表達變化將導致營養(yǎng)生長、生殖生長、細胞的增殖速度、育性、衰老速度以及葉片大小的變化[16]。TCP基因家族被證明能調控植物葉片大小和形狀[19]，但該轉錄因子在鐵觀音茶樹中的功能研究較少，本研究克隆得到鐵觀音茶樹CsTCP4基因，對其特征進行生物信息學分析，探究確定鐵觀音茶樹CsTCP4基因對于茶樹葉片的調控作用，為鐵觀音茶樹種質資源研究利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植在福建農(nóng)林大學福州校區(qū)南區(qū)茶園的鐵觀音品種茶樹為樣品材料，采摘一芽一二葉鮮葉迅速用液氮固樣，置于-80℃冰箱貯藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉錄 參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒方法提取茶樹總RNA，參考Takara公司的SMARTer 5′/3′ Kit Component試劑盒說明書，逆轉錄成cDNA用于RACE擴增。

1.2.2 TCP4基因5′端的克隆 根據(jù)陳志丹的前期試驗[20]得出的已知片段TDP49，設計兩條3′RACE上游引物TDF49 3′-1和 TDF49 3′-2，以AP為逆轉錄引物進行反轉錄，然后以反轉錄的cDNA為模板進行巢氏PCR擴增，第一輪反應引物用TDF49 3′-1和AUAP，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，以TDF49 3′-2和AUAP作為引物進行第二輪擴增。

1.2.3 TCP4基因3′端的克隆 對于TCP4基因5′端序列的擴增，采用5′-RACE CDS Prime A進行反轉錄，然后以反轉錄的cDNA為模板進行巢氏PCR擴增，以UPM和TDF49 5′-1進行第一輪擴增，將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋100位模板，以UPM和TDF49 5′-2為引物進行第二輪擴增。

2 結果與分析

2.1 鐵觀音茶樹總RNA的提取與檢測

從提取的鐵觀音茶樹RNA的電泳檢測圖譜(圖1)可知，RNA的28S和18S的條帶清晰，而28S rRNA的亮度和18S rRNA相比，亮了將近1倍，經(jīng)紫外分光光度計檢測結果(見表2)，OD260/OD280值在1.8～2.2之間，說明樣品中沒有蛋白質和其它有機物的污染，且沒有水解為單核酸，OD260/OD230大于2，說明RNA樣品中沒有其它小分子物質的干擾，因此可見提取的總RNA具有很好的完整性和很高的純度，可以滿足后續(xù)RACE擴增需要。

表1 鐵觀音茶樹轉錄因子TCP4克隆涉及引物信息

圖1 鐵觀音茶樹轉錄因子TCP4的克隆

表2 鐵觀音茶樹總RNA濃度

2.2 鐵觀音茶樹TCP基因cDNA全長的克隆及序列分析

2.2.1 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA 3′RACE的克隆與序列分析 以AP為逆轉錄引物進行反轉錄的cDNA作為模板，利用兩條3′RACE的上游引物進行兩輪PCR擴增，測序結果表明該3′RACE的產(chǎn)物為845 bp，與預期大小相符，且與已知保守區(qū)片段有100bp的堿基重疊，所以可以確定所獲得的片段為鐵觀音茶樹TCP基因的3′RACE部分。

2.2.2 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA 5′RACE的克隆與序列分析 以5′RACE CDS Primes A反轉錄的cDNA 為模板進行巢氏PCR擴增，測序結果表明該5′RACE產(chǎn)物的片段長度為472bp，與預期大小相符，且與已知片段有108bp重疊堿基，所以可以確定此片段為鐵觀音茶樹TCP基因的5′RACE部分。

2.2.3 鐵觀音茶樹TCP基因cDNA全長序列分析 使用DNAman軟件將5′RACE、已知序列和3′RACE cDNA核苷酸序列進行拼接，獲得TCP基因的基因全長序列為1264bp(圖3)，其中開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為795bp，編碼264個氨基酸，5′非編碼區(qū)為171bp，3′非編碼區(qū)為298bp，ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子。

2.3 鐵觀音茶樹轉錄因子TCP4生物信息學分析

2.3.1 氨基酸序列的構成成分和理化性質 利用DNAman軟件對TCP氨基酸進行基本信息分析，鐵觀音茶樹TCP4基因開放閱讀框為795bp，編碼264個氨基酸。使用Expasy網(wǎng)站對其氨基酸基礎結構及性質進行相關分析可知，轉錄因子TCP的組成有氨基酸264個；理論等電點是7.01；相對分子量是29559.02kDa；負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為30個；正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為30個；不穩(wěn)定指數(shù)為58.57>40，屬于不穩(wěn)定蛋白；蛋白的親水性平均系數(shù)(GRAVY值)是-0.717<0，屬于親水性蛋白；分子式：C1287H2010N372O407S11，總原子數(shù)為4087，氨基酸組成中絲氨酸(Ser)含量最高，為11.7%，谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)占比均為7.6%，含量僅次于絲氨酸。

圖2 鐵觀音茶樹TCP基因的cDNA全長序列

2.3.2 鐵觀音茶樹TCP的系統(tǒng)進化樹構建分析 采用MEGA5.05軟件的NJ法，將鐵觀音茶樹TCP基因的氨基酸序列與已知的茶樹、草莓、桃樹等14種TCP基因的氨基酸序列進行同源進化樹分析(圖3)。結果表明，所克隆出的鐵觀音茶樹TCP蛋白與草莓、桃樹蛋白的一致性高達100%，在親緣關系上最接近。其次是亞麻薺，與胡桃、棗、葡萄等的進化距離較遠。

圖3 鐵觀音茶樹TCP系統(tǒng)進化樹

2.3.3 磷酸化位點的預測分析 真核細胞的蛋白質磷酸化位點能夠識別和修飾不同蛋白質的不同位點，是生物體內(nèi)一種普遍的調節(jié)方式，主要發(fā)生在絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)殘基側鏈的羥基上，在細胞信號轉導的過程中發(fā)揮重要作用。結果表明，TCP基因含有多個磷酸化位點，其中絲氨酸位點最多，其次是蘇氨酸位點，絡氨酸位點最少，只有1個。說明磷酸化和去磷酸化的調控作用很大程度上影響到鐵觀音茶樹TCP4轉錄因子蛋白的活性，如表3，圖4所示。

表3 鐵觀音茶樹TCP4磷酸化位點推測

圖4 鐵觀音茶樹TCP4蛋白磷酸化位點推測圖

2.3.4 信號肽分析 利用在線網(wǎng)站SignalP對此序列進行信號肽分析，根據(jù)meanS-score大于0.5則預測為分泌蛋白，存在信號肽，小于0.5則沒有信號肽，如圖5所示，可知茶樹轉錄因子TCP4不存在信號肽序列，屬于非分泌蛋白轉錄因子TCP蛋白。

圖5 鐵觀音茶樹TCP4蛋白信號肽分析

2.3.5 跨膜區(qū)域推測 通過TMpred對鐵觀音茶樹TCP基因進行跨膜區(qū)域分析，跨膜區(qū)域存在不同的兩類(圖6)。第一類是從外向內(nèi)的跨膜螺旋，一處跨膜區(qū)位于182～204位氨基酸之間，得分率是787(++)；第二處跨膜區(qū)在219～238氨基酸之間，得分率是121(++)，總得分是908。第二類是從內(nèi)向外的跨膜螺旋，僅存在一處跨膜，位于189～211位氨基酸之間，得分率是388。而TCP家族屬于轉錄因子家族，與DNA結合在細胞核內(nèi)進行，因此上述兩種現(xiàn)象都不予以采用，TCP蛋白沒有參與跨膜的可能。

2.3.6 蛋白的功能結構域分析 SMART軟件分析結果表明該蛋白在25～160的位置具有一定的活性(圖7)。同時經(jīng)過Prosite軟件分析結果表明，該蛋白還具有TCP家族特征多肽序列：RKDRHSKVCTARGPKDRRVRLSAHTAIQFYDVQDRLGYGRPSEAIDWLMKEAKSAIDAL，位于27-85位置(圖8)。

3 討論

TCP家族成員在細胞的伸長調控、雌雄配子發(fā)育、種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、葉片衰老、茉莉酸合成、光形態(tài)建成以及生物鐘調節(jié)等方面發(fā)揮著重要功能[5]，TCP家族被劃分為classI和classII兩個亞族，classI由相關度較高的蛋白組成，被稱為PCF亞家族(PCF1和PCF2)，主要是通過PCNA基因的啟動子對DNA生理生化產(chǎn)生影響[3]，對植物生長發(fā)育進行正調控。classII對植物生長起到負調控作用，據(jù)其結構域差異又被分成兩個分支，CIN和ECE(CYC/TB1)，CIN分支主要參與到植物葉片、子葉等邊緣器官的發(fā)育，變異會導致葉片不正常且邊緣褶皺[21-26]。

圖 6 鐵觀音茶樹TCP4蛋白跨膜區(qū)域分析

圖7 鐵觀音茶轉錄因子TCP基因編碼蛋白的功能構域

圖8 鐵觀音茶樹TCP合成酶活性位點

根據(jù)本試驗的分析結果顯示，鐵觀音茶樹轉錄因子CsTCP4屬于classII家族的CIN分支。Nath等人發(fā)現(xiàn)，CIN基因的突變會影響金魚草的葉片形態(tài)，認為CIN基因會促進葉緣生長停滯[27]。CIN型轉錄因子對葉片形態(tài)變化功能的作用在擬南芥、金魚草和番茄等已有研究，證明該基因能夠限制正在發(fā)育的葉原基邊源的細胞增殖[22]。其次在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，TCP4基因也是作為MicroRNA319a的靶基因參與到葉片的調控過程[3]。TCP4表達出現(xiàn)變化將導致營養(yǎng)生長、生殖生長、細胞的增殖速度、育性、衰老速度以及葉片大小的變化[16],有相關研究表明，TCP4基因表達若是向上調整，會引起植物花瓣變得狹小，花藥的生長發(fā)育缺乏。而且它能促使茉莉酸的合成，進一步影響葉片的衰老過程。根據(jù)克隆出來的鐵觀音茶樹TCP4基因的cDNA全長序列，采用生物信息學方式進行分析得出，它由264個氨基酸組成，分子量為29559.02kDa；等電點為7.01；屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定蛋白；未含信號肽；磷酸化和去磷酸化的調控在很大程度上影響到TCP4轉錄因子蛋白的活性基因；含有特殊固有的bHLH結構域。構建系統(tǒng)進化樹，得出CsTCP4基因與草莓和桃樹的TCP親緣關系比較近。綜上所述，推測出CsTCP4基因在鐵觀音茶樹的生長發(fā)育中主要調控葉片的的生長發(fā)育，尤其是對葉片形態(tài)方面起到一定的影響作用。在前期研究中，本研究試驗材料供體鐵觀音茶樹也顯示出茶樹生長樹型較直立、葉片生長較為旺盛、茶樹葉片呈現(xiàn)稍斜向上生長的性狀，基因熒光定量表達分析也顯示該基因在試驗茶樹樣品中表達量較高，因此推測該株鐵觀音茶樹的這些性狀可能與TCP4基因高表達的正向調控有關，后期試驗可以運用實時熒光定量PCR技術，研究CsTCP4 基因在鐵觀音茶樹不同時期和葉位的表達量，具體還需要進一步開展基因功能驗證研究分析，從而利用科學手段來改變表達程度，調節(jié)葉片的生長發(fā)育，改良基因遺傳特性，調整生長模式，對培育出整體品質更高的鐵觀音茶樹有指導意義。