張亞輝，姚萬(wàn)玲，文艷巧，華永麗，紀(jì) 鵬，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070)

大腸濕熱證系指濕熱蘊(yùn)結(jié)大腸，下焦氣機(jī)壅滯，致使大腸傳導(dǎo)失職，所表現(xiàn)出來的一系列以泄瀉下痢為主的證候。在獸醫(yī)臨床中常見多發(fā)，給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)造成一定損失。郁金散為治療大腸濕熱證的經(jīng)典中獸藥方劑，具有澀腸止瀉、利濕導(dǎo)滯、清熱解毒、調(diào)血行氣、止痛等功效[1]。

有研究表明，濕熱證本質(zhì)與機(jī)體免疫、氧化與抗氧化等功能密切相關(guān)[2]。濕熱證是內(nèi)外濕邪共同作用引起的急性外感熱病，濕熱病邪侵犯機(jī)體與正氣相爭(zhēng)，出現(xiàn)“濕阻”“熱蘊(yùn)”的病理變化，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中病原微生物感染引起機(jī)體免疫功能紊亂的機(jī)制相似[3]。濕熱證的外感病邪與病毒、細(xì)菌等的感染有直接關(guān)系，病原微生物感染則會(huì)引起機(jī)體氧化應(yīng)激現(xiàn)象[4]。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)密不可分，免疫細(xì)胞處于氧化與抗氧化平衡中維持細(xì)胞正常功能。大腸濕熱證會(huì)使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，過量ROS會(huì)阻滯Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞不能正常進(jìn)行有絲分裂，最終導(dǎo)致淋巴細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；同時(shí)過量ROS氧化血清白蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)自身抗體合成[5]，從而加劇免疫功能的紊亂。

本課題組以前的研究表明：郁金散可通過抗腹瀉、抗炎、降血脂、緩解血瘀、修復(fù)腸黏膜以及調(diào)節(jié)和保護(hù)多臟器等多方面的綜合作用治療大腸濕熱證[6]，另外可通過調(diào)控機(jī)體胃腸激素水平而調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)功能[7]。因此，本研究在此基礎(chǔ)上，通過各組大鼠血清免疫球蛋白的檢測(cè)及相關(guān)免疫器官的系統(tǒng)觀察，以及分析血清及肝抗氧化因子的變化，以從體液免疫、抗氧化功能等方面闡明郁金散對(duì)大腸濕熱證的治療作用機(jī)制，為開發(fā)治療大腸濕熱證型腹瀉藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，切片機(jī)(Leica公司)，OlympusDP-71顯微照相系統(tǒng)，白酒(北京紅星二鍋頭，56°)，IgA、IgG、IgM、一氧化氮(NO)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)。

1.2 大腸桿菌懸液制備

菌種為產(chǎn)毒性大腸桿菌O101，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，菌號(hào)CVCC231。菌株保存在-80 ℃條件下備用。臨用前室溫下解凍，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)18 h，然后接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃振蕩培養(yǎng)至所需濃度，置4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 郁金散制備

根據(jù)《中獸醫(yī)學(xué)》配方組成[1]：郁金30 g、白芍15 g、黃芩30 g、訶子15 g、黃柏30 g、黃連30 g、大黃60 g、梔子30 g，進(jìn)行郁金散制備：按比例稱取藥物于10倍水中浸泡30 min，武火煮沸后改用文火煎煮30 min，4層紗布過濾；藥渣再以6倍水重復(fù)煎煮30 min；合并兩次濾液，減壓濃縮，定容至1.04 g·mL-1，置4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)《中國(guó)獸藥典》計(jì)算大鼠臨床等效給藥劑量為0.52 g·mL-1，設(shè)置郁金散高、中、低劑量分別為10.4、5.2、2.6 g·kg-1。以上中藥均購(gòu)自甘肅西域陽(yáng)光大藥房，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)魏彥明教授鑒定。

1.4 動(dòng)物分組及造模

60只體重180～220 g的Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，購(gòu)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(甘)2013-0002。自然環(huán)境，常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分6組，每組10只：分別為正常對(duì)照組、模型組、自愈組、郁金散高、中、低劑量組。按照實(shí)驗(yàn)室建立的方法[6-7]進(jìn)行大腸濕熱證模型復(fù)制，分3個(gè)階段，(1)高糖高脂階段：模型組，自愈組，郁金散高、中、低劑量組大鼠造模全程自由飲用300 g·L-1蜂蜜水，單日禁食，雙日飼喂充足飼料并灌服豬油2 mL·100 g-1，共10 d；(2)高溫高濕階段：除對(duì)照組大鼠，其余大鼠每天灌喂56°白酒(北京紅星二鍋頭)1 mL·100 g-1，置于高溫倉(cāng)(溫度31～35 ℃，相對(duì)濕度93%±2%)8 h·d-1，共5 d；(3)攻毒階段：經(jīng)高溫高濕階段的大鼠腹腔注射濃度為1.69×109CFU·mL-1的產(chǎn)毒性大腸桿菌菌液0.2 mL·100 g-1，24 h后，再以0.1 mL·100 g-1的劑量注射一次，自然環(huán)境飼養(yǎng)1 d，模型建立成功。造模完成后，處死模型組大鼠取樣。郁金散高、中、低劑量組分別以10.4、5.2、2.6 g·(kg·d)-1劑量灌胃方藥，共5 d；自愈組灌服等量生理鹽水。試驗(yàn)期間，正常對(duì)照組處于自然環(huán)境，喂普通飼料，灌胃、腹腔注射等量生理鹽水。試驗(yàn)結(jié)束后處死所有大鼠取樣。

1.5 樣本采集

大鼠處死前禁食12 h，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉(30 mg·kg-1)，腹主動(dòng)脈采血收集于真空采血管中，室溫靜置2～4 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。采血完畢，迅速剖取脾、胸腺，用生理鹽水洗凈，放入10%的福爾馬林(即4%甲醛)溶液中固定，用來制作病理切片。迅速剖取肝，用預(yù)冷生理鹽水洗凈，稱取0.5 g左右，加生理鹽水1∶9進(jìn)行勻漿，4 ℃ 3 500 r·min-1離心15 min，再以2 500 r·min-1離心10 min，分別吸取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血清免疫球蛋白的檢測(cè)

按ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)各組血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平。

1.7 病理組織切片觀察

將脾和胸腺組織用10%福爾馬林溶液固定15 d， 漂洗組織中的固定液，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，進(jìn)行石蠟包埋，切片(4 μm)，常規(guī)HE染色，用顯微照相系統(tǒng)觀察并采集照片。

1.8 血清及肝抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)

按ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)血清及肝組織勻漿上清液LPO、MDA、GSH、NO水平。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié) 果

2.1 血清免疫球蛋白含量變化

由圖1可知：與正常對(duì)照組相比，模型組中IgA、IgM和IgG含量極顯著升高(P<0.01)；自愈組中IgA含量顯著升高(P<0.05)，IgM和IgG含量極顯著升高(P<0.01)。與自愈組相比，郁金散高劑量組中IgA和IgM的含量顯著降低(P<0.05)，IgG含量極顯著降低(P<0.01)；郁金散中劑量組中IgM含量顯著降低(P<0.05)，IgA和IgG的含量降低，但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，大腸濕熱證模型大鼠血清IgA、IgM和IgG含量升高，郁金散治療后其含量下降，其中高劑量治療效果最好。

標(biāo)有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖1 血清中IgA、IgM和IgG的含量變化Fig.1 Change of content of IgA,IgM and IgG in serum

2.2 脾組織學(xué)觀察

顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組，脾紅、白髓分界清楚，組織形態(tài)正常，動(dòng)脈周圍淋巴鞘無(wú)異常變化，而紅髓中可見含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞，表明脾免疫功能正常(圖2A、a)。大腸濕熱證模型組，紅、白髓界限模糊，白髓比例上升；紅細(xì)胞數(shù)目增多，沒有含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞；白髓中淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，可見壞死的淋巴細(xì)胞；紅髓中有大量淋巴細(xì)胞彌漫性增生和浸潤(rùn)(圖2B、b)。治療組白髓與紅髓分界比較清楚；未見含鐵血黃素的巨噬細(xì)胞，但形態(tài)正常；動(dòng)脈周圍淋巴鞘的形態(tài)較正常組變化不明顯，而淋巴細(xì)胞數(shù)目相較于正常對(duì)照組少(圖2C、c)。

2.3 胸腺組織學(xué)觀察

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞密集(圖3a)，髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞稀松(圖3A)，形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)正常。大腸濕熱證模型組，未被脂肪代替的胸腺組織，皮質(zhì)、髓質(zhì)交界模糊，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，小葉內(nèi)皮質(zhì)網(wǎng)狀細(xì)胞增生，胸腺小體數(shù)量減少，小血管充血，皮質(zhì)部被脂肪代替的胸腺組織，可以看到有大量的脂肪細(xì)胞(圖3B、b)。郁金散高劑量治療組，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞密集，被膜較厚(圖3C)，髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞少而稀疏，形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)趨于正常(圖3c)。

2.4 血清中抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

由圖4可知：與正常對(duì)照組相比，模型組MDA、LPO含量極顯著升高(P<0.01)，GSH和NO含量極顯著降低(P<0.01)；自愈組MDA含量顯著升高(P<0.05)，LPO含量極顯著升高(P<0.01)，GSH和NO含量顯著降低(P<0.05)。與自愈組相比，高劑量組MDA顯著降低(P<0.05)，LPO含量極顯著降低(P<0.01)，GSH和NO含量顯著升高(P<0.05)；中劑量組LPO含量極顯著降低(P<0.01)，MDA的含量降低，但差異不顯著(P>0.05)，GSH和NO含量升高，但差異不顯著(P>0.05)；低劑量組LPO含量極顯著降低(P<0.01)，MDA含量降低但差異不顯著(P>0.05)，GSH和NO含量升高但差異不顯著(P>0.05)。說明郁金散能夠降低大腸濕熱證機(jī)體血清中的MDA和LPO，升高血清中GSH和NO，且高劑量郁金散的效果最好。

A、a.正常對(duì)照組；B、b.大腸濕熱證模型組；C、c.郁金散高劑量治療組。箭頭表示白髓；三角箭頭表示紅髓A, a. Normal control group; B, b. LIDHS model group; C, c.High dose of Yujin Powder groups. The arrows indicate white pulps; The triangular arrow indicate red pulps圖2 脾病理組織學(xué)觀察(HE染色)Fig.2 Spleen histopathological observation (HE staining)

A、a.正常對(duì)照組；B、b.大腸濕熱證模型組；C、c.郁金散高劑量治療組。五角星代表髓質(zhì)；三角形表示皮質(zhì)；箭頭指充血血管；三角箭頭指脂肪細(xì)胞A, a. Normal control group; B, b. LIDHS model group; C, c.High dose of Yujin Powder groups. The pentagram represents the medulla and the triangle represents the cortex； Arrows indicate vascular congestion； The triangular arrow refers to fat cells圖3 胸腺病理組織學(xué)觀察(HE染色)Fig.3 Thymus histopathological observation (HE staining)

標(biāo)有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖4 血清中MDA、GSH、LPO、NO的含量Fig.4 Content of MDA, GSH, LPO, NO in serum

2.5 肝組織中抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

由圖5可知：與正常對(duì)照組相比，模型組中MDA和LPO含量極顯著升高(P<0.01)，NO含量極顯著降低(P<0.01)，GSH含量極顯著降低(P<0.01)；自愈組MDA含量極顯著升高(P<0.01)，LPO含量顯著升高(P<0.05)，NO和GSH含量顯著降低(P<0.05)。與自愈組相比，高劑量組MDA含量極顯著降低(P<0.01)，LPO顯著降低(P<0.05)，NO極顯著升高(P<0.01)，GSH顯著升高(P<0.05)；中劑量組LPO含量顯著降低(P<0.05)，NO和GSH含量顯著升高(P<0.05)；低劑量組MDA、LPO、NO和GSH均差異不顯著。說明郁金散能升高大腸濕熱證大鼠肝中的NO和GSH含量，降低MDA和LPO含量，且高劑量效果最好。

3 討 論

3.1 郁金散對(duì)大腸濕熱證大鼠血清免疫球蛋白及免疫器官的調(diào)節(jié)

本研究中發(fā)現(xiàn)大腸濕熱證大鼠血清IgM、IgA和IgG的含量顯著升高，提示免疫系統(tǒng)功能變化在濕熱證轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)歸中起重要作用。中醫(yī)辨證屬濕熱證的患者存在著免疫功能異?，F(xiàn)象[8]。陳江華等[9]對(duì)濕熱證患者體液免疫狀況的臨床研究發(fā)現(xiàn)，濕熱證患者血清IgA、IgM、IgG、C3水平較正常人顯著升高。白愛平等[10]、佟麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱證機(jī)體免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、C3、C4補(bǔ)體水平顯著升高。這與本研究結(jié)果一致。體液免疫增強(qiáng)，可能與濕熱證為多種急性熱病，機(jī)體對(duì)致病微生物等的急性炎癥反應(yīng)，免疫系統(tǒng)對(duì)病原微生物的錯(cuò)誤識(shí)別引起的自身免疫反應(yīng)[12]等有關(guān)。經(jīng)郁金散治療后，濕熱證大鼠IgM、IgA和IgG含量顯著降低。說明郁金散可以有效緩解大腸濕熱證引起的體液免疫亢進(jìn)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

標(biāo)有不同字母表示差異極顯著(大寫字母，P<0.01)或差異顯著(小寫字母，P<0.05)，標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)Values with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 肝中MDA、GSH、LPO、NO的含量Fig.5 Content of MDA, GSH, LPO, NO in liver

脾是免疫應(yīng)答、進(jìn)而產(chǎn)生抗體分泌細(xì)胞的關(guān)鍵免疫器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可反映免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的狀態(tài)[13]。胸腺是中樞免疫器官，T、B細(xì)胞發(fā)育的重要場(chǎng)所之一[14]。本研究大腸濕熱證模型組大鼠脾和胸腺組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，脾白髓與紅髓界限模糊，淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，可見壞死的淋巴細(xì)胞。胸腺組織皮質(zhì)、髓質(zhì)交界模糊，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，胸腺小體數(shù)量減少。這些結(jié)果表明大腸濕熱證可引起大鼠脾和胸腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，淋巴細(xì)胞的異常凋亡，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常。郁金散高劑量組，脾紅、白髓交界較為清晰，淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，但低于正常組；胸腺皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞密集，被膜較厚。提示經(jīng)郁金散治療后，各器官形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常。這些結(jié)果表明郁金散可有效緩解大腸濕熱證引起的免疫器官的功能異常。

郁金散影響機(jī)體免疫功能的可能原因：郁金散組方中君藥郁金對(duì)體液免疫具有抑制作用[15]。臣藥中黃連可抑制免疫細(xì)胞凋亡，減輕免疫器官萎縮[16]；黃芩化學(xué)成分黃芩苷、黃芩素具有免疫調(diào)節(jié)作用；黃柏能夠抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，從而抑制細(xì)胞免疫，減輕炎癥損傷[17]。佐藥中大黃可顯著提高免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞的增殖能力[18]；白芍總苷具有多途徑抑制自身免疫反應(yīng)的作用[19]；訶子同樣具有免疫調(diào)節(jié)作用[20]。因此，郁金散可通過降低大腸濕熱證機(jī)體血液中免疫球蛋白的含量，調(diào)節(jié)體液免疫，同時(shí)通過調(diào)節(jié)免疫器官功能達(dá)到治療大腸濕熱證的目的。

3.2 郁金散對(duì)大腸濕熱證大鼠抗氧化相關(guān)因子的調(diào)節(jié)

本研究結(jié)果顯示，大腸濕熱證大鼠血清和肝中MDA和LPO的含量顯著性升高，GSH和NO含量下降。徐萌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，濕熱證動(dòng)物模型由于病原微生物的刺激而發(fā)生不同程度的氧化應(yīng)激，致使機(jī)體LPO和MDA水平升高。佟麗等[11]、張霓[22]研究表明濕熱證大鼠模型MDA含量上升。這與本研究結(jié)果一致。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其水平可反應(yīng)組織過氧化損傷的程度；LPO濃度的改變可直接反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度。本研究MDA、LPO含量增高，提示濕熱證機(jī)體脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度過高，出現(xiàn)明顯的過氧化損傷。劉德傳等[23]研究表明，濕熱證模型大鼠GSH-Px活性明顯降低，NO含量顯著下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果相符。GSH可清除體內(nèi)自由基和ROS，防止肝細(xì)胞損傷[24]。NO是一種重要的非酶抗氧化劑，正常水平會(huì)起到清除氧自由基的作用，且NO在高溫?fù)p傷過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25-26]。GSH水平降低提示機(jī)體自由基清除障礙，抗氧化能力減弱，NO含量降低則加劇高溫?fù)p傷。對(duì)中醫(yī)濕熱證證候的應(yīng)用研究表明，濕熱證患者和模型動(dòng)物機(jī)體氧化反應(yīng)增強(qiáng)，抗氧化功能減弱，細(xì)胞膜完整性受損，引起壞死，從而導(dǎo)致大量病理產(chǎn)物堆積[27]，這是濕熱證形成的關(guān)鍵。因此，大腸濕熱證模型大鼠機(jī)體中存在嚴(yán)重的氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡。

經(jīng)郁金散治療后，MDA、LPO、GSH和NO的含量均明顯回調(diào)，且郁金散高劑量組效果最明顯，各指標(biāo)含量趨于正常。藥理研究表明，郁金散組方中黃連、黃柏、梔子具有清除自由基、脂質(zhì)過氧化的作用[17, 28-29]；黃芩可減少自由基產(chǎn)生及體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)細(xì)胞膜的保護(hù)作用[30]；白芍的活性成分五沒食子酰基葡萄糖有抗氧化活性[31]；訶子提取物可顯著增加模型鼠體內(nèi)GSH的含量，降低LPO的含量[32]；大黃中的大黃酚可增強(qiáng)抗氧化酶的活性，減少過氧化脂質(zhì)[33]。表明郁金散具有調(diào)節(jié)機(jī)體氧化和抗氧化功能，增強(qiáng)清除自由基的能力，減輕機(jī)體過氧化損傷，提高機(jī)體免疫力，從而起到治療大腸濕熱證的作用。

4 結(jié) 論

大腸濕熱證機(jī)體存在免疫功能異常和氧化/抗氧化失衡現(xiàn)象，郁金散可通過調(diào)控大腸濕熱證機(jī)體的免疫功能和抗氧化/氧化平衡而治療大腸濕熱證。為研究郁金散治療大腸證的機(jī)制以及開發(fā)治療濕熱證疾病的藥物奠定了理論基礎(chǔ)。