王 琪，齊仁立，劉 虹，王 敬，黃金秀*

(1. 重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460； 2. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是一類含有共軛雙鍵的十八碳脂肪酸的統(tǒng)稱，常見(jiàn)于反芻動(dòng)物的脂肪中，具有抗腫瘤、改善動(dòng)物免疫、抑制氧化應(yīng)激、減少體內(nèi)脂肪沉積和調(diào)控肌肉生長(zhǎng)等多種生理功能[1-3]。肌肉組織是動(dòng)物體內(nèi)最重要的組織之一，研究表明，CLA可通過(guò)改變骨骼肌的肌纖維類型來(lái)改善豬肉品質(zhì)；CLA還能通過(guò)影響肌肉的生理變化如調(diào)控肌肉代謝信號(hào)傳導(dǎo)通路、影響肌肉能量代謝，從而增加動(dòng)物機(jī)體瘦肉重和改變肌肉蛋白質(zhì)含量[4-6]。

microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度為20～24 nt的非編碼小RNA。miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因 3′非編碼區(qū)結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而參與多種生物學(xué)功能[7]。研究證實(shí)，miRNA在肌肉細(xì)胞分化和組織生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而動(dòng)物膳食結(jié)構(gòu)的改變能影響其肌肉組織miRNA的表達(dá)；如肥胖小鼠飼糧中添加煙酸可顯著改變骨骼肌中42個(gè)miRNAs表達(dá)[8-9]，生長(zhǎng)豬飼喂不同能量來(lái)源的飼糧能顯著影響肌肉組織中miR-23a、miR-409和miR-208b的表達(dá)[10]。飼糧中添加CLA也能影響機(jī)體組織miRNA表達(dá)，但目前CLA對(duì)miRNA表達(dá)影響的研究?jī)H集中在脂肪上，Parra等[11-12]發(fā)現(xiàn)，小鼠飼糧中添加CLA能顯著改變脂肪組織中miR-143、miR-103和miR-107等的表達(dá)，豬飼糧中添加CLA則能顯著下調(diào)脂肪組織miR-143和miR-27的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)育肥期飼糧中添加1%～1.5% CLA能顯著促進(jìn)生長(zhǎng)豬背最長(zhǎng)肌的重量，增加肌內(nèi)脂肪的含量并改變肌肉中脂肪酸的組成[13-14]。Corino等[15]研究證實(shí)，母豬妊娠期和泌乳期飼糧添加CLA可顯著提高仔豬生長(zhǎng)性能。然而，飼糧中長(zhǎng)期添加CLA對(duì)豬肌肉miRNA表達(dá)譜造成怎樣的影響及其存在的分子機(jī)理目前還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在母豬及其子代飼糧中添加1.5% CLA，研究其對(duì)于子代肌肉組織miRNA表達(dá)譜的影響，從而探明CLA對(duì)豬肌肉組織中miRNA的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和樣品采集

試驗(yàn)選取12頭平均體重為60.83 kg和背膘厚為24.16 mm的初產(chǎn)榮昌母豬，隨機(jī)分為對(duì)照組和CLA組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭母豬。CLA組母豬的飼糧從妊娠初期開(kāi)始添加1.5% CLA混合物，持續(xù)到仔豬28日齡斷奶；仔豬斷奶后，按照公母各半的原則分別從對(duì)照組和CLA組挑選健康仔豬各30頭，分成6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5頭仔豬；斷奶后原CLA組仔豬飼糧中繼續(xù)添加1.5% CLA混合物，對(duì)照組仔豬飼糧中不添加。對(duì)照組母豬和斷奶后仔豬的飼養(yǎng)水平參照榮昌豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 7223-2008)和中國(guó)豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T65-2004)進(jìn)行配制，試驗(yàn)組飼糧中的CLA等比例替代基礎(chǔ)飼糧中的大豆油，其他組分和營(yíng)養(yǎng)成分與對(duì)照組一致。仔豬30 kg左右時(shí)，每組選擇6頭仔豬(3頭母豬和3頭公豬)進(jìn)行屠宰，采集背最長(zhǎng)肌(背肌)及腿肌組織樣品，于液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA文庫(kù)的構(gòu)建

Trizol試劑法提取肌肉組織總RNA，每組3份樣品進(jìn)行等量混合，檢測(cè)混合后總RNA質(zhì)量，保證RIN(RNA integrity number)值為7.5～9.0。使用PAGE膠分離不同片段大小的RNA，切取18～30 nt之間的條帶進(jìn)行回收；分別配制3′和5′連接體系，混勻離心后適溫連接；配制反轉(zhuǎn)錄體系，在PCR儀上適溫反應(yīng)一定時(shí)間，使連接產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成雙鏈，再配制PCR反應(yīng)體系，在PCR儀上按照一定程序進(jìn)行擴(kuò)增；使用PAGE膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，完成文庫(kù)構(gòu)建。分別對(duì)對(duì)照組和CLA組的背肌和腿肌(混樣)進(jìn)行建庫(kù)，每個(gè)組設(shè)定一個(gè)重復(fù)，因此共有8個(gè)庫(kù)，包括背肌對(duì)照組Ⅰ、背肌對(duì)照組Ⅱ、背肌CLA組Ⅰ、背肌CLA組Ⅱ、腿肌對(duì)照組Ⅰ、腿肌對(duì)照組Ⅱ、腿肌CLA組Ⅰ和腿肌CLA組Ⅱ。構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢后在Illumina HiSeq 2000 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序工作由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 已知miRNA的鑒定

測(cè)序原始序列(raw reads)去除低質(zhì)量、接頭污染和長(zhǎng)度小于18 nt的序列，獲得clean reads。通過(guò)SOAP和bowtie將篩選后的sRNA定位到豬參考基因組上(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-87/gtf/sus_scrofa/)，去除rRNA、tRNA、scRNA、snRNA和snoRNA等小RNA。然后將剩余序列與miRBase 21.0 (http://www. mirbase.org/)中豬的已知miRNA進(jìn)行比對(duì)，確定已知的miRNA，用mirdeep軟件預(yù)測(cè)新miRNA。

1.4 差異表達(dá)miRNA篩選和候選靶基因功能分析

對(duì)樣本中已知miRNA進(jìn)行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)，用TPM[16]進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理，采用SPSS 18.0中的描述統(tǒng)計(jì)(descriptive statistics)分析數(shù)據(jù)，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示miRNA表達(dá)量。使用ExpDiff方法比較對(duì)照組和CLA組之間miRNA表達(dá)量的差異，分析對(duì)照組和CLA組中已知miRNA的差異倍數(shù)(fold change)及P值，篩選差異表達(dá)的miRNA。用miRanda和RNAhybrid軟件對(duì)差異表達(dá)的已知miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，取交集作為預(yù)測(cè)結(jié)果。使用KEGG代謝通路分析確定候選靶基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.5 熒光定量PCR驗(yàn)證測(cè)序

為驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，在背肌和腿肌各選擇3個(gè)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。按照反轉(zhuǎn)錄SYBR?Prime ScriptRMmiRNA RT-PCR試劑盒(TaKaRa，Japan)的說(shuō)明書(shū)步驟獲得cDNA，特異性上游引物根據(jù)所選miRNA的自身序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)，下游引物為通用引物，選擇U6為內(nèi)參基因。用SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa，Japan)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，體系：模板2.0 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX Reference Dye, 0.8 μL miRNA特異引物，0.8 μL下游引物(試劑盒自帶)，加ddH2O使總體積為20 μL。所有的反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)結(jié)果通過(guò)2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量的統(tǒng)計(jì)分析。

表1熒光定量PCR引物序列

Table1TheprimerssequenceforqRT-PCR

miRNA名稱miRNA name引物序列(5'→3')Primer sequencessc-miR-224CAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAssc-miR-4332CACGGCCGCCGCCGGGCGCCssc-miR-628ATGCTGACATATTTACTAGAGGssc-miR-151-5pTCGAGGAGCTCACAGTCTAGTssc-miR-144TACAGTATAGATGATGTACssc-miR-1285CTGGGCAACATAGCGAGACCCCGTU6GCTTCGGCAGCACATATACT

2 結(jié) 果

2.1 豬肌肉組織測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾和sRNA序列信息

經(jīng)過(guò)Solexa測(cè)序得到的raw data數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，主要包括去除接頭、污染及低質(zhì)量序列等。本試驗(yàn)一共構(gòu)建8個(gè)文庫(kù)，背肌組4個(gè)文庫(kù)總共獲得了44 869 982條clean reads，占總數(shù)的95.10%；而腿肌組4個(gè)文庫(kù)則獲得了45 105 806條clean reads，占總數(shù)的95.09%(表2)。背肌和腿肌中小RNA序列長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖1，絕大多數(shù)序列長(zhǎng)度為20～23 nt，其中22 nt長(zhǎng)度序列占的比例最大。miRNA在由前體發(fā)育為成熟體時(shí)其過(guò)程是由Dicer酶切完成的，酶切位點(diǎn)的特異性使得miRNA成熟體的首位堿基具有很強(qiáng)的偏好性，圖2統(tǒng)計(jì)了背肌和腿肌中長(zhǎng)度為18～30 nt miRNA首位堿基分布情況，發(fā)現(xiàn)第一個(gè)堿基對(duì)U具有強(qiáng)烈的偏好性。

2.2 豬肌肉組織已知miRNA鑒定分析

通過(guò)blast或bowtie將sRNA與miRBase 21.0中豬(Susscrofa)miRNAs序列進(jìn)行比對(duì)，背肌和腿肌組織中分別鑒定出306和304個(gè)已知miRNAs，有295個(gè)miRNAs共表達(dá)，其中ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-26a、ssc-miR-10b和ssc-miR-128等多個(gè)miRNAs在背肌和腿肌組織中均高表達(dá)。作為肌肉特異性miRNA,ssc-miR-1、ssc-miR-206和ssc-miR-133a-3p的表達(dá)量均超過(guò)百萬(wàn)拷貝數(shù)(圖3)。

2.3 添加CLA對(duì)豬肌肉miRNA表達(dá)的影響

在飼糧中持續(xù)添加CLA影響豬背肌和腿肌miRNA表達(dá)，對(duì)CLA組和對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化之后的表達(dá)值進(jìn)行差異比較，并把差異倍數(shù)取2為底的對(duì)數(shù)，以log2(Fold change)表示，正值代表上調(diào)，負(fù)值代表下調(diào)。結(jié)果表明，添加CLA后背肌中有151個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，155個(gè)表達(dá)下調(diào)；腿肌中有141個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，163個(gè)表達(dá)下調(diào)。腿肌中有17個(gè)miRNAs的log2(Fold change)大于1，而背肌中只有7個(gè)；腿肌中有13個(gè)miRNA的log2(Fold change)小于-1，而背肌中只有6個(gè)(表3)。說(shuō)明CLA對(duì)腿肌miRNA表達(dá)的影響要強(qiáng)于背肌。

表2測(cè)序文庫(kù)的小RNA片段質(zhì)量分類

Table2TheclassificationofsmallRNAtagsinsequencinglibraries

分類Type背肌 Back muscle對(duì)照組IControl group I對(duì)照組IIControl group IICLA組ICLA group ICLA組IICLA group II原始序列Total reads12 039 29011 319 17212 054 53411 766 943高質(zhì)量序列High quality11 992 92111 268 06612 001 61311 712 746無(wú)3'接頭 3'adapter null211 522255 760172 667188 809無(wú)插入片段Insert null123 251111 545155 638150 7135'接頭污染 5'adapter contaminant29 96325 70934 71627 803小于18 nt Smaller than 18 nt111 414117 133158 020230 238包含polyA Poly A72126122143純凈序列Clean reads11 516 69910 757 79311 480 45011 115 040分類Type腿肌 Leg muscle對(duì)照組IControl group I對(duì)照組IIControl group IICLA組ICLA group ICLA組IICLA group II原始序列Total reads11 319 17211 547 16412 419 84212 144 824高質(zhì)量序列High quality11 268 06611 496 61012 363 66012 098 777無(wú)3'接頭 3'adapter null255 760187 021214 316292 296無(wú)插入片段Insert null111 545103 416111 132201 3195'接頭污染 5'adapter contaminant25 70931 03547 27148 732小于18 nt Smaller than 18 nt117 133120 093114 339139 781包含polyA Poly A1261457563純凈序列Clean reads10 757 79311 054 90011 876 52711 416 586

每個(gè)組設(shè)定一個(gè)重復(fù)，以I和II表示

The replicate expressed as I and II in each group

以log2(Fold change)>1或<-1，P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選對(duì)照組和CLA組之間顯著差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加CLA顯著改變了背肌中ssc-miR-224、ssc-miR-9841-3p、ssc-miR-4332、ssc-miR-628和ssc-miR-339-3p的表達(dá)；顯著改變了腿肌中12個(gè)miRNAs的表達(dá)，其中5個(gè)表達(dá)上調(diào)，7個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中只有ssc-miR-224在豬背肌和腿肌都差異表達(dá)(表4)。此外，背肌和腿肌組織中有8個(gè)差異表達(dá)miRNAs的差異倍數(shù)發(fā)生了4倍以上的改變，包括背肌中的ssc-miR-9841-3p和ssc-miR-339-3p，以及腿肌中的ssc-miR-151-5p、ssc-miR-215、ssc-miR-194b-5p、ssc-miR-452、ssc-miR-205和ssc-miR-545-3p。

2.4 肌肉中16個(gè)差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)和功能分析

CLA組豬的背肌和腿肌中分別有5個(gè)和12個(gè)miRNAs顯著差異表達(dá)，其中ssc-miR-224在兩種組織中都差異表達(dá)，因此共有16個(gè)差異表達(dá)miRNAs。用RNAhybrid和miRanda分析軟件對(duì)差異表達(dá)的16個(gè)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到5 155個(gè)靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG功能分析，發(fā)現(xiàn)其共富集到292條生物學(xué)通路中，其中有24個(gè)顯著富集通路(P<0.05，表5)。顯著富集通路中，Notch信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路都曾報(bào)道與肌肉發(fā)育和代謝密切相關(guān)。靶基因富集最多的前5個(gè)通路包括：代謝通路(376個(gè))、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控(182個(gè))、癌癥通路(160個(gè))、黏著斑(148個(gè))、MAPK信號(hào)通路(138個(gè))，其中，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、黏著斑和MAPK信號(hào)通路都為顯著富集通路(P<0.05)。

2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA

在表4中隨機(jī)選擇6個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證。在背肌中檢測(cè)ssc-miR-224、ssc-miR-4332和ssc-miR-628的表達(dá)，在腿肌中則檢測(cè)ssc-miR-151-5p、ssc-miR-144和ssc-miR-1285的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果采用 2-△△CT進(jìn)行計(jì)算，并以log2(CLA組/對(duì)照組)得出相對(duì)表達(dá)情況。由圖4可知，miRNA的表達(dá)變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果基本一致，但qRT-PCR檢測(cè)到的表達(dá)水平變化幅度要小于測(cè)序。

圖1 背肌(A)和腿肌(B)中小RNA序列長(zhǎng)度分布Fig.1 Length distribution of small RNA sequence in back muscle(A) and leg muscle(B)

圖2 背肌(A)和腿肌(B)中18～30 nt miRNA的首位堿基偏向性Fig.2 First nucleotide bias of miRNA with 18-30 nt in back muscle(A) and leg muscle(B)

圖3 背肌(A)和腿肌(B)表達(dá)量前10的miRNAsFig.3 The top 10 expressed miRNAs in back muscle(A) and leg muscle(B)

表3添加CLA后對(duì)背肌和腿肌中miRNAs差異表達(dá)倍數(shù)的影響

Table3EffectsofCLAsupplementationonlog2(Foldchange)ofmiRNAsinbackmuscleandlegmuscle

log2差異倍數(shù)log2(Fold change)背肌Back muscle腿肌Leg musclemiRNAs數(shù)量Number of miRNAs百分比/%PercentmiRNAs數(shù)量Number of miRNAs百分比/%Percent>300.0020.66>1且≤372.29154.93>0.5且≤1237.52237.57>0.1且≤0.57825.496822.37>0且≤0.14314.053310.86>-0.1且≤0299.48299.54≤-0.1且>-0.510133.017825.66≤-0.5且>-1196.214314.14≤-1且>-361.96134.28

表4添加CLA后肌肉中顯著差異表達(dá)的miRNAs

Table4SignificantdifferentiallyexpressedmiRNAsinmuscleresponsingtoCLAtreatment

miRNA名稱miRNA name對(duì)照組Control groupCLA組CLA group差異倍數(shù)Fold changelog2差異倍數(shù)log2(Fold change)P值P-value背肌Back musclessc-miR-22443.08±6.9620.40±4.500.47-1.080.01ssc-miR-9841-3p0.93±0.147.26±0.907.772.960.01ssc-miR-43325.40±0.4116.33±3.503.031.600.01ssc-miR-62820.63±0.7043.16±4.242.091.070.01ssc-miR-339-3p1.52±0.507.00±1.514.602.200.04腿肌Leg musclessc-miR-151-5p702.27±34.654 148.04±388.315.912.560.00ssc-miR-2156.81±1.2863.30±2.739.303.220.00ssc-miR-194b-5p1.98±0.0024.60±3.2312.423.630.00ssc-miR-12275.37±9.19231.04±38.893.071.620.00ssc-miR-45271.78±6.8715.58±4.340.22-2.200.00ssc-miR-144554.78±53.50254.21±49.000.46-1.130.00ssc-miR-18434.03±4.1499.47±9.092.921.550.01ssc-miR-1285293.46±26.87143.85±13.440.49-1.030.01ssc-miR-22488.18±8.2829.35±2.820.33-1.590.01ssc-miR-20514.20±2.533.14±0.830.22-2.180.03ssc-miR-299118.55±7.0753.28±4.740.45-1.150.03ssc-miR-545-3p9.38±0.711.60±0.500.17-2.550.03

表516個(gè)差異表達(dá)miRNAs靶基因的KEGG通路富集分析

Table5KEGGpathwayanalysisfortargetgenesof16differentiallyexpressedmiRNAs

KEGG通路KEGG pathway靶基因數(shù) Gene numberP值P-value通路ID號(hào)Pathway ID氨基苯甲酸降解Aminobenzoate degradation120.000ko00627血管平滑肌收縮Vascular smooth muscle contraction1250.000ko04270心肌收縮Cardiac muscle contraction820.001ko04260晝夜節(jié)律-植物Circadian rhythm-plant60.001ko04712緊密連接Tight junction1270.001ko04530軸突導(dǎo)向Axon guidance1130.002ko04360葉酸合成Folate biosynthesis130.002ko00790肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控Regulation of actin cytoskeleton1820.002ko04810酗酒Alcoholism790.002ko050345-羥色胺能神經(jīng)突觸Serotonergic synapse690.003ko04726肥厚型心肌病Hypertrophic cardiomyopathy (HCM)1090.005ko05410唾液分泌Salivary secretion600.008ko04970可卡因成癮Cocaine addiction350.009ko05030谷氨酸能突觸Glutamatergic synapse670.011ko04724擴(kuò)張型心肌病Dilated cardiomyopathy1090.011ko05414胰島素信號(hào)通路Insulin signaling pathway860.013ko04910致病性大腸埃希菌感染Pathogenic Escherichia coli infection590.016ko05130沙門氏菌感染Salmonella infection890.023ko05132丁酰苷菌素和新霉素的生物合成Butirosin and neomycin biosynthesis60.024ko00524Notch信號(hào)通路Notch signaling pathway310.032ko04330雙組分系統(tǒng)Two-component system200.034ko02020黏著連接Adherens junction630.035ko04520黏著斑Focal adhesion1480.043ko04510MAPK信號(hào)通路MAPK signaling pathway1380.044ko04010

A.背??； B. 腿肌A.Back muscle； B. Leg muscle圖4 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.4 qRT-PCR validation for the differentially expressed miRNA

3 討 論

3.1 豬肌肉組織中高表達(dá)的miRNA

骨骼肌是機(jī)體進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所，主要作用是控制運(yùn)動(dòng)及維持姿勢(shì)。所有的身體活動(dòng)和體育活動(dòng)，都是由骨骼肌收縮完成[17]。miRNA作為重要的調(diào)控因子，與骨骼肌的發(fā)育代謝密切相關(guān)[18]。本研究中，背肌和腿肌表達(dá)量前10的miRNAs包括ssc-miR-206、ssc-miR-1、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-26a、ssc-miR-10b、ssc-miR-128、ssc-miR-378、ssc-let-7a、ssc-miR-126-3p和ssc-miR-22-3p。其中，miR-206、miR-1和miR-133a-3p屬于肌源miRNA，主要參與肌細(xì)胞增殖和分化等過(guò)程[19]。Qin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a、miR-10b、miR-128、miR-378和let-7a在豬骨骼肌中高表達(dá)，與本研究的結(jié)果一致。另外兩個(gè)高表達(dá)miRNAs，miR-126-3p和miR-22-3p則報(bào)道與平滑肌細(xì)胞的增殖有關(guān)[21-22]。結(jié)果說(shuō)明，這些高表達(dá)的miRNA在肌肉組織中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

3.2 添加CLA后肌肉中差異表達(dá)miRNA功能分析

CLA對(duì)miRNA表達(dá)影響的研究主要集中在脂肪上，目前尚未有CLA對(duì)肌肉組織miRNA表達(dá)譜影響的報(bào)道。本研究通過(guò)在豬飼糧中添加1.5% CLA，對(duì)豬背肌和腿肌組織進(jìn)行miRNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析，旨在探明miRNA在CLA調(diào)控肌肉發(fā)育和代謝中發(fā)揮何種作用。結(jié)果顯示，添加CLA對(duì)腿肌miRNA表達(dá)的影響要強(qiáng)于背肌，說(shuō)明CLA對(duì)不同的部位肌肉影響效果不同。背肌和腿肌組織中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNAs，其中只有ssc-miR-224在兩種組織中都差異表達(dá)。有報(bào)道稱，miR-224與動(dòng)物脂肪細(xì)胞的成脂分化相關(guān)，可通過(guò)長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶4(ACSL4)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝；也有報(bào)道認(rèn)為，miR-224通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響脂肪酸分解代謝并控制脂肪堆積[23-24]。另外15個(gè)差異表達(dá)的miRNAs中，Wang等[25-29]研究認(rèn)為，miR-4332能調(diào)控豬肌肉中脂肪沉積，miR-122、miR-215、miR-194和miR-205等則被證實(shí)與脂代謝相關(guān)；其他一些miRNAs，如miR-628、miR-151-5p和miR-339-3p等報(bào)道與肌肉的發(fā)育或疾病的發(fā)生有關(guān)[30-32]。說(shuō)明CLA可能通過(guò)影響肌肉中重要miRNA表達(dá)調(diào)控肌肉脂肪沉積和發(fā)育代謝。

3.3 差異表達(dá)miRNAs靶基因功能和通路分析

通過(guò)對(duì)16個(gè)差異表達(dá)miRNAs靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)5 155個(gè)靶基因顯著富集到24條代謝通路中，其中MAPK信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路與肌肉代謝密切相關(guān)。MAPK家族成員主要包括P38 MAPK、ERK 1/2和JNK，這些因子參與到細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化、凋亡等多種生理過(guò)程[33-34]。Segalés等[35-37]發(fā)現(xiàn)，這3條MAPK通路在調(diào)控肌細(xì)胞的成脂轉(zhuǎn)分化中起到不同的作用，抑制P38 MAPK能促進(jìn)細(xì)胞成脂分化，增強(qiáng)脂肪代謝；阻斷ERK 1/2抑制脂肪形成；阻斷JNK則刺激脂肪分解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，P38 MAPK還具有促進(jìn)肌細(xì)胞成肌分化，抑制其增殖的作用。Lee等[38-39]研究證實(shí)，肌細(xì)胞增殖過(guò)程中，添加c9, t11-CLA能增加細(xì)胞ERK 1/2和JNK的磷酸化水平，增加細(xì)胞分化過(guò)程中ERK 1/2的磷酸化水平，說(shuō)明CLA可能通過(guò)影響MAPK通路中關(guān)鍵蛋白來(lái)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞的增殖和分化。

Notch通路在調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育和再生中起關(guān)鍵作用，Bi等[40-41]發(fā)現(xiàn)，Notch1通過(guò)激活效應(yīng)基因Hes5，來(lái)調(diào)節(jié)豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖并維持細(xì)胞狀態(tài)；激活Notch信號(hào)通路能促進(jìn)肌細(xì)胞增殖，但抑制肌細(xì)胞分化。有報(bào)道顯示，Notch通路還能調(diào)控肌肉糖代謝[42]。目前未見(jiàn)關(guān)于CLA對(duì)肌細(xì)胞中Notch通路影響的相關(guān)報(bào)道，但添加CLA能顯著提高肌肉中棕櫚酸的含量[14]，而體外試驗(yàn)證實(shí)棕櫚酸能提高肌細(xì)胞趨化因子配體1(CXCL1)表達(dá)水平，敲除CXCL1可減少肌細(xì)胞增殖，顯著降低Notch蛋白質(zhì)水平，因此推測(cè)，CLA可能是通過(guò)影響肌肉中其他脂肪酸含量變化來(lái)調(diào)控Notch信號(hào)通路的[43]。

4 結(jié) 論

豬飼糧中持續(xù)添加1.5% CLA可以顯著改變背肌和腿肌組織miRNA的表達(dá)，背肌和腿肌組織中共得到16個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，且其靶基因顯著富集到24個(gè)信號(hào)通路，包括MAPK信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路，提示CLA可通過(guò)改變肌肉miRNA表達(dá)調(diào)控肌肉重要代謝通路，進(jìn)而影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。