甘心夢(mèng)，陳凱文，劉賀賀，李彥瑩，王繼文，李 亮，白麗麗

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130)

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)基因家族是機(jī)體最早被發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)，可以準(zhǔn)確識(shí)別一種或多種病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，能啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，同時(shí)也是連接先天性免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-3]。根據(jù)脊椎動(dòng)物TLRs基因家族的胞外結(jié)構(gòu)域可以將其分為T(mén)LR1(1、2、6、10)、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7(7、8、9)、TLR11、TLR13(13、21)、TLR15八大亞家族[4]。不同物種TLRs基因家族在進(jìn)化中保持著相似的結(jié)構(gòu)和功能，但其成員組成差別大。果蠅有9種TLRs基因，哺乳動(dòng)物有13種，其中TLR1～10能在人上特異性表達(dá)，小鼠上能表達(dá)12種TLRs(TLR1～9、TLR11～13)[5-6]，而雞和鴨均有10種TLRs基因，其中TLR15為禽類(lèi)特有[7]。禽類(lèi)TLRs基因家族廣泛分布于機(jī)體各組織器官中。在雞不同胚齡組織中，各TLRs基因的表達(dá)存在極顯著差異(P<0.01)[8]。TLR3和TLR7能介導(dǎo)鴨對(duì)病毒感染的先天免疫過(guò)程[9]。TLR4主要參與脂多糖(LPS)的識(shí)別，注射LPS能刺激雞小腦的TLR4極顯著上調(diào)(P<0.01)[10-11]。由此可見(jiàn)，分析組織器官中TLRs家族成員的表達(dá)變化可以為探究其功能提供依據(jù)。

法氏囊作為禽類(lèi)特有的中樞免疫器官，是影響其發(fā)育、功能形成和免疫功能發(fā)揮的大量關(guān)鍵基因的聚集地[12]。在雞5胚齡時(shí)法氏囊開(kāi)始發(fā)育，9～28日齡為生長(zhǎng)高峰，56日齡后開(kāi)始退化[13]。而鴨法氏囊在17周齡時(shí)開(kāi)始退化[14]。研究發(fā)現(xiàn)，雞法氏囊中的TLR3和TLR15、TLR2a和TLR4基因分別在識(shí)別馬立克氏病毒和新城疫病毒中起著關(guān)鍵作用[15-16]。

基因家族各成員一般來(lái)源于祖先基因的基因重復(fù)以及分子進(jìn)化[17-18]?；蛑貜?fù)導(dǎo)致了基因多樣化發(fā)展，而隨著新功能和基因缺失的增加，基因家族出現(xiàn)亞功能化，最終導(dǎo)致進(jìn)化分歧[19-20]。在其他物種上，F(xiàn)oxO基因家族和Coq1基因家族等都在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中呈現(xiàn)出了不同形式的功能分化[21-22]。為探尋鴨TLRs基因家族各成員的功能差異，本研究擬檢測(cè)TLRs家族各成員mRNA在鴨法氏囊胚后發(fā)育各階段的相對(duì)表達(dá)模式，并結(jié)合分析啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以探討TLRs基因家族表達(dá)模式、功能分化與基因分子進(jìn)化的關(guān)系，進(jìn)一步為T(mén)LRs基因家族的研究分析提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水禽育種場(chǎng)提供的0、2、4和6周齡的健康農(nóng)華肉鴨(GF2)，每周齡公母各3只(共24只)，屠宰后采集法氏囊樣品，并用液氮研磨后放入-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鴨法氏囊TLRs的定量引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鴨TLRsmRNA基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)TLRs基因編碼區(qū)定量引物(表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，用Blast程序?qū)y(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)引物的正確性和特異性，包括鴨TLRs基因家族全部10個(gè)成員。

1.2.2 鴨法氏囊TLRs的PCR擴(kuò)增和qRT-PCR反應(yīng) 采用Trizol法提取鴨法氏囊的總RNA，檢測(cè)濃度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄(試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司)合成模板DNA(cDNA)，稀釋后作為檢測(cè)模板在熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定TLRs各成員的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

PCR反應(yīng)體系為10 μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s，各基因退火溫度如表1所示，退火時(shí)間30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。

表1鴨TLRs基因和內(nèi)參基因定量引物信息

Table1InformationofprimersofduckTLRsandreferencegene

基因名稱(chēng)Gene name引物序列(5'→3')Primer sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProduct size退火溫度/℃Annealing temperatureTLR1aF: TGTCAGGAATTTGGGACCATR: GCTGTTAGACTTTGAGGCTTGT15860TLR1bF: TGTCCTTCATCTAACAGTCCCTR: TGCTCCTCGGCTCCATC22760.8TLR2aF: GACAATCTGTAAAGATGCTTGGCR: TCACACACATCTGGAATCTCACC16260TLR2bF: GTTGAGGTGGAGATGAAAGACTR: ACAGCCTGAAGATCCGTAAA14960TLR3F: ATGTCATGCAAACCTGACCAR: CCAGGGTCTTGAAAGGATCA23960TLR4F: GGTGCCACATCCATACAAR: CCAATCGGTAGGTCAGTCAG18160TLR5F: GATGCCATTTGGAACAGR: AACTACTACCATAACGAGGAC14160TLR7F: TGCTGTTATGAGCCACCTR: AACCAATTCTGTCATCACCC17260TLR15F: ATAGCGGAGGACACTTTCGGR: ATCTGAATGCCCAAGGAGC23363TLR21F: ACCTGGGCTTCTACCTCTTCACCR: GTCGTAGACGTAGCGCTCCTCCT16761.9β-actinF: GCTATGTCGCCCTGGATTTCR: CACAGGACTCCATACCCAAGAA16860

F.上游引物;R.下游引物

F.Forward primer;R.Reverse primer

qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR@Premix EX TapTM(2×) 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；65～95 ℃按0.5 ℃增值進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析。

1.2.3 構(gòu)建TLRs編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)TLRs基因序列均下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。使用了人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)和鴨(Anasplatyrhynchos)的TLRs編碼區(qū)序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)序列。利用MEGA 7.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining)，Bootstrap分析重復(fù)數(shù)為1 000，構(gòu)建TLRs基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其余參數(shù)默認(rèn)不變(表2)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

qRT-PCR結(jié)果用Excel 2016整理，采用2-ΔΔC(T)方法計(jì)算，結(jié)果使用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。用Graphpad Prism 7.0繪圖，Mev軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，SPSS 22.0的ANOVA方法進(jìn)行顯著性比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 鴨法氏囊胚后發(fā)育過(guò)程中TLRs的表達(dá)

PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果顯示，每個(gè)產(chǎn)物均得到單一目的條帶，且與預(yù)期片段長(zhǎng)度一致(圖1)，說(shuō)明定量引物特異性較好。通過(guò)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)找到每個(gè)TLR定量引物的最適熔解溫度(表1)。從圖2可以看出，TLR2a的表達(dá)水平在鴨法氏囊胚后發(fā)育的W2和W6時(shí)期顯著高于W4時(shí)期(P<0.05)，其余TLRs各成員在鴨法氏囊胚后發(fā)育期的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)。

表2系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)參考基因信息

Table2Theinformationofreferencegenesofphylogenetictree

物種Species基因名稱(chēng)Gene name染色體Chromosome編碼區(qū)登錄號(hào)Coding sequence accession No.啟動(dòng)子區(qū)序列Promoter sequence登錄號(hào)Accession No.起始位點(diǎn)/bpStart position終止位點(diǎn)/bpEnd position人Homo sapiensTLR14NM_003263.3NC_000004.1238 798 83238 800 831TLR24NM_001318787.1NC_000004.1221 61923 618TLR34NM_003265.2NC_000004.12186 074 621186 076 620TLR49NM_003266.3NC_000009.12117 702 474117 704 473TLR51NM_003268.5NC_000001.11223 113 032223 115 031TLR64NM_006068.4NC_000004.1238 829 47438 831 473TLR7XNM_016562.3NC_000023.1112 865 58012 867 579TLR8XNM_016610.3NC_000023.1112 904 70812 906 707TLR93NM_017442.3NC_000003.1252 225 52952 227 528TLR104NM_001017388.2NC_000004.1238 775 59038 777 589小鼠Mus musculusTLR15NM_001276445.1NC_000071.664 927 23364 929 232TLR23NM_011905.3NC_000069.683 841 03983 843 038TLR38NM_126166.5NC_000074.645 403 14245 405 141TLR44NM_021297.3NC_000070.666 825 83266 827 831TLR51NM_016928.3NC_000067.6182 970 435182 972 434TLR65NM_011604.4NC_000071.664 955 56364 957 562TLR7XNM_001290755.1NC_000086.7167 330 004167 332 003TLR8XNM_001313760.1NC_000086.7167 263 752167 265 751TLR99NM_031178.2NC_000075.6106 220 704106 222 703TLR1114NM_205819.3NC_000080.650 356 01650 358 015TLR124NM_205823.2NC_000070.6128 618 456128 620 455TLR13XNM_205820.1NC_000086.7106 145 578106 147 577雞Gallus gallusTLR1a4NM_001007488.4NC_006091.469 961 23369 963 232TLR1b4NM_001081709.3NC_006091.469 953 09169 955 090TLR2a4NM_204278.1NC_006091.420 187 47720 189 476TLR2b4NM_001161650.1NC_006091.420 195 14320 197 142TLR34NM_001011691.3NC_006091.461 705 19761 707 196TLR417NM_001030693.1NC_006104.44 081 1144 083 113TLR53NM_001024586.1NC_006090.417 867 80717 869 806TLR71NM_001011688.2NC_006088.4123 414 224123 416 223TLR153NM_001037835.1NC_006090.43 023 9213 025 920TLR2111NM_001030558.1NC_006098.4389 044391 043

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

1013(scaffold)指TLR21基因在鴨第1013號(hào)scaffold上

1013(scaffold) refers to theTLR21 gene on duck’s No.1013 scaffold

圖1 TLRs的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 The PCR amplification electrophoresis results of TLRs

同一基因在4個(gè)時(shí)期的表達(dá)中，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences of the same gene expression among 4 periods (P<0.05)圖2 鴨法氏囊胚后發(fā)育中TLRs的表達(dá)情況Fig.2 The expression of TLRs in the postembryonic development stage of duck bursa of Fabricius

2.2 鴨法氏囊TLRs表達(dá)聚類(lèi)分析

如圖3，TLR1a、TLR2a和TLR2b的表達(dá)模式相近，TLR3、TLR5和TLR15也接近，TLR1b和TLR21的表達(dá)模式相近，TLRs基因家族的表達(dá)模式可以分為兩大類(lèi)：TLR1a、TLR4、TLR2a、TLR2b和TLR7為一類(lèi)，其余的TLR3、TLR5、TLR15、TLR1b和TLR21歸為一類(lèi)。

圖3 鴨法氏囊胚后發(fā)育期TLRs表達(dá)量熱圖Fig.3 The expression heatmap of TLRs in the postembryonic development stage of duck bursa of Fabricius

2.3 TLRs編碼區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

分析TLRs編碼區(qū)進(jìn)化樹(shù)(圖4b)可以看出，人、小鼠、雞和鴨的TLRs基因較為對(duì)應(yīng)的聚在同一分支上。TLR1(1a、1b)和TLR2(2a、2b)聚為一支，與禽類(lèi)特有的TLR15距離較近；TLR3和TLR5在同一個(gè)分支節(jié)點(diǎn)上；TLR4和TLR21為單獨(dú)兩分支；雞和鴨的TLR7與人和小鼠的TLR7、TLR8、TLR9聚在同一支；禽類(lèi)的TLR21與其他TLRs距離最遠(yuǎn)。而基于TLRs啟動(dòng)子區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)無(wú)明顯規(guī)律(圖4a)。

3 討 論

在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中，TLRs基因家族是極為重要的模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別脂多糖、鞭毛蛋白、dsRNA等PAMPs在先天性免疫反應(yīng)中扮演著重要角色[23]。TLRs基因家族的表達(dá)與其行使的功能緊密相關(guān)。TLR3和TLR7分別參與了雞法氏囊對(duì)傳染性法氏囊病毒和H9N2禽流感病毒的感染應(yīng)答，表明TLRs在禽類(lèi)免疫信號(hào)感知以及法氏囊免疫功能發(fā)揮等方面扮演了重要角色[24-25]。然而，最早發(fā)現(xiàn)的果蠅Toll基因被認(rèn)為是一個(gè)發(fā)育調(diào)控蛋白，雞TLRs基因在10胚齡到2日齡期間存在明顯的表達(dá)變化，雛鴨免疫器官中TLRs的表達(dá)從33胚齡到1日齡呈顯著上升趨勢(shì)[26-28]。這些研究提示，TLRs基因家族的表達(dá)與胚胎發(fā)育調(diào)控和早期免疫功能有關(guān)。在胚胎發(fā)育階段，獲得性免疫尚未發(fā)育完全，先天性免疫系統(tǒng)已經(jīng)建立了應(yīng)對(duì)早期致病性攻擊的免疫準(zhǔn)備[29]。

研究發(fā)現(xiàn)，TLRs基因在2～21日齡的雛雞上并不存在時(shí)期表達(dá)特異性[27]。在10和30日齡的雞法氏囊上也并無(wú)差異表達(dá)基因涉及到TLRs信號(hào)通路[30]。本研究結(jié)果與現(xiàn)有報(bào)道基本一致，除TLR2a外，其余TLRs成員在鴨法氏囊發(fā)育階段的表達(dá)均不存在顯著差異(P>0.05)，提示TLRs基因的表達(dá)情況基本穩(wěn)定，可能不參與鴨法氏囊胚后發(fā)育調(diào)控過(guò)程。另外，禽類(lèi)TLR2a能識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁成分，功能與哺乳動(dòng)物的TLR2和TLR4相近[31]。本研究中，TLR2a在4周齡鴨法氏囊的表達(dá)水平顯著低于2和6周齡(P<0.05)，這可能與該時(shí)期鴨法氏囊識(shí)別細(xì)菌的功能有關(guān)，然而僅檢測(cè)TLRs的表達(dá)水平并不能完全代表Toll樣受體蛋白的表達(dá)情況[32]，因此，TLR2a對(duì)4周齡鴨法氏囊的發(fā)育及功能有何影響還有待進(jìn)一步研究。

基因家族的進(jìn)化是由祖先基因通過(guò)重復(fù)和歧化進(jìn)化而來(lái)，各成員可能具有相同或相關(guān)的功能[18]。同時(shí)基因的進(jìn)化也會(huì)向著不同物種和種系特異性的方向發(fā)展，從而產(chǎn)生特有的基因[33]。Toll基因最初只具有促進(jìn)機(jī)體發(fā)育的功能，而由于受到病原體介導(dǎo)的正向選擇壓力的作用，導(dǎo)致TLRs基因在不同物種的進(jìn)化中出現(xiàn)差異[19]。本研究中，TLR1a和TLR1b、TLR2a和TLR2b具有較高的同源性，TLR3、TLR5和TLR15的遺傳距離較近，TLR21與其余TLRs的遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)?；蚣易逯懈鞒蓡T的表達(dá)模式比較可以為探究該基因家族的生理生化功能和基因功能分化提供重要信息[34]。如Lopes-Marques等[20]對(duì)ACSLs基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，ACSL1a和1b、ACSL3a和3b、ACSL4a和4b的進(jìn)化距離較近，其中ACSL3a和3b、ACSL4a和4b功能相似，而ACSL1a和ACSL1b的組織分布表達(dá)完全不同，提示其功能存在差異。結(jié)合分析TLRs的表達(dá)模式與序列進(jìn)化發(fā)現(xiàn)，TLR2a和TLR2b，以及TLR3、TLR5和TLR15具有相似的表達(dá)模式和較近的遺傳距離，提示其可能具有相似的功能。鴨TLR1a和TLR1b的同源性較高，但表達(dá)模式不同，表明可能在基因進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了功能分化。

A為T(mén)LRs啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)化樹(shù)；B為T(mén)LRs編碼區(qū)進(jìn)化樹(shù)，標(biāo)記為T(mén)LRs各成員所在的亞家族A is phylogenetic tree based on TLRs promoter sequence; B is phylogenetic tree based on TLRs coding sequence, the TLRs included in each family are also labeled圖4 TLRs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic trees of TLRs

啟動(dòng)子區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，是調(diào)控基因表達(dá)、決定基因活動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)，TLRs各成員的表達(dá)模式差異是否與啟動(dòng)子區(qū)的序列進(jìn)化有關(guān)？為此，本研究對(duì)TLRs家族各成員啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了聚類(lèi)分析，未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律，這可能是因?yàn)榛虻谋磉_(dá)與調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，涉及到了多個(gè)基因和多條信號(hào)通路，因此TLRs基因家族表達(dá)模式差異可能與啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)化無(wú)關(guān)。

4 結(jié) 論

TLRs家族成員在鴨法氏囊中均有表達(dá)，且在胚后發(fā)育階段表達(dá)變化不明顯，提示TLRs家族成員可能不參與鴨法氏囊胚后發(fā)育調(diào)控過(guò)程；TLR2a和TLR2b，以及TLR3、TLR5和TLR15具有相似的表達(dá)模式和較近的遺傳距離，其功能可能相關(guān)；TLR1a和TLR1b雖然具有較高的序列相似性，但表達(dá)模式不同，可能出現(xiàn)了功能分化。研究排除了TLRs表達(dá)模式與啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)化的聯(lián)系。