鄧?yán)螅翱∧?，趙勝軍，肖希龍

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2.武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢430023)

紫蘇葉、藿香、淡竹葉、白術(shù)均為容易栽培、資源豐富、價格低廉的天然植物藥物。此四味草藥組成方劑三葉白術(shù)湯具有芳香解表，健脾化濕的功效。此研究對三葉白術(shù)湯的遺傳毒性進行研究，為其作為新獸藥的臨床安全性評價提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物 三葉白術(shù)湯口服液由武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室自制，批號為160315，為綜紅色澄明液體，由紫蘇、藿香、淡竹葉、白術(shù)等成分組成水煎濃縮而成，每毫升含生藥量1 g。豬的臨床推薦量為0.1 mL/kg·bw，每日口服1次。

1.2 試驗系統(tǒng) 三項遺傳毒理試驗所用菌株、細(xì)胞和實驗動物均符合《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]推薦的試驗系統(tǒng)。Ames試驗所用試驗菌株為組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，染色體畸變試驗所用試驗細(xì)胞為中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞株(CHL)，兩個試驗所需的S9肝微粒體酶，均購自美國MOLTOX公司；經(jīng)生物特性鑒定合格后用于試驗。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗使用SPF級昆明系雄性小鼠30只，7～8周齡[1-2]，體重28～30 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號為：SCXK(京)2011-0012。

1.3 試驗儀器和試劑 試驗儀器：BX51光學(xué)顯微鏡(Olympus)，XSP-17CZ倒置顯微鏡(上海長方光學(xué)儀器有限公司)；L535R臺式超低溫高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；AC2-4S1生物安全柜(ESCO新加坡藝思潔凈設(shè)備有限公司)；2306-2二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(美國SHELLAB)；DH6000II電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)等。

試驗試劑：瓊脂粉(SIGMA)，氧化型輔酶Ⅱ(Roche)，葡萄糖-6-磷酸(Sigma公司)；DMEM/HIGH GLUCOSE (Hyclone公司)；Giemsa染液(Solorbio公司)；環(huán)磷酰胺(SIGMA-ALDRICH公司)；秋水仙堿(Sigma公司)；絲裂霉素C(Biotopped公司)；敵克松，2-氨基蒽(Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)；疊氮鈉(Sigma公司)；2-氨基芴(Sigma公司)/1,8-二羥基蒽醌(Merck公司)等。

1.4 試驗方法

1.4.1 Ames試驗[1～4]將受試物在無菌條件下加無菌蒸餾水先20倍稀釋后再5倍倍比稀釋4次，獲得濃度為50 000、10 000、2 000、400、80 μg/mL共5個濃度，同時設(shè)陰性對照組(無菌蒸餾水)及陽性對照組敵克松500 μg/mL，疊氮鈉15 μg/mL，二氨基蒽200 μg/mL，1，8-二羥基蒽醌100 μg/mL，2-氨基蒽200 μg/mL。所有的受試物組均需在加入和不加入S9的條件下進行。陽性組設(shè)計為：在+S9條件下TA97a，TA98和TA100的陽性對照品為2-氨基芴，TA102的陽性對照品為1,8-二羥基蒽醌，TA1535的陽性對照品為2-氨基蒽；在-S9條件下TA97a，TA98和TA102的陽性對照品為敵克松，TA100和TA1535的陽性對照品為疊氮鈉。試驗采用平板摻入法，每皿加入0.1 mL受試物/對照品，0.1 mL菌液和0.5 mL S9混合液(+S9)。將所有平皿培養(yǎng)48 h進行菌落計數(shù)。根據(jù)指導(dǎo)原則要求，Ames試驗至少重復(fù)一次進行驗證。

1.4.2 中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)染色體畸變試驗[1,5-6]將受試物在無菌條件下用無菌蒸餾水稀釋至濃度為50、16.67、5.56 mg/mL共3個濃度。同時設(shè)陰性對照為無菌蒸餾水，設(shè)陽性對照為環(huán)磷酰胺(80 μg/mL，+S9))和絲裂霉素C(4 μg/mL，-S9)。試驗需在±S9的條件下進行。試驗步驟和方法參考《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》和“GB 15193.23-2014”等指導(dǎo)原則進行，將CHL細(xì)胞用藥物進行6 h，24 h，48 h處理，然后制成玻片標(biāo)本。并顯微鏡下閱片。根據(jù)閱片記錄計算畸變率：畸變率(%)=(染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗[1-2,7]30只雄性小鼠分為5組，每組6只，采用灌胃給藥。分別設(shè)2 000、1 000、500 mg/kg劑量組，陰性對照組給予稀釋藥物用的蒸餾水，陽性組給予環(huán)磷酰胺40 mg/kg。陽性組給藥1次后22～24 h，其他組給藥2次后22～24 h，采用頸椎脫臼法處死動物，取骨髓涂片、固定、Giemsa染色并于顯微鏡下閱片。每只動物計數(shù)2 000個嗜多染紅細(xì)胞中出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)，計算微核率，以千分率表示。另外，計數(shù)每只動物200個紅細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞與總紅細(xì)胞(嗜多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞)的比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 Ames試驗 根據(jù)每個平皿的回復(fù)突變菌落數(shù)，統(tǒng)計平均回復(fù)突變菌落數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。受試物組的菌株回變菌落數(shù)應(yīng)等于或大于未處理陰性對照組的2倍以上，且具有劑量-反應(yīng)關(guān)系或某一測試點具有可重復(fù)增加則判定陽性結(jié)果[4,6]，否則為陰性。

1.5.2 中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)染色體畸變試驗 經(jīng)方差分析(χ2檢驗)，受試物所誘發(fā)的染色體畸變率與陰性對照組相比，出現(xiàn)濃度依賴性的增加，或出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，并且與陰性對照組相比，差異顯著(P≤0.05)，可判定為陽性結(jié)果，否則為陰性。

1.5.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗 經(jīng)方差分析。當(dāng)受試物組微核率出現(xiàn)劑量依賴性升高，并且與對照組微核率比較有顯著差異時(P<0.05)，判定為陽性反應(yīng)，否則為陰性。

2 試驗結(jié)果

2.1 Ames試驗 Ames試驗結(jié)果見表1和表2。兩次Ames試驗三葉白術(shù)湯口服液各劑量組菌落數(shù)均未超過陰性對照組的2倍。說明三葉白術(shù)湯口服液沒有誘發(fā)TA97a，TA98，TA100，TA102和TA1535五種菌株產(chǎn)生回復(fù)突變的作用，試驗結(jié)果為陰性。

2.2 中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)染色體畸變試驗 CHL染色體畸變試驗結(jié)果見表3。試驗結(jié)果顯示，在此研究試驗條件下，三葉白術(shù)湯口服液5、1.67 mg/mL和0.56 mg/mL三濃度均沒有致CHL細(xì)胞染色體畸變率升高，試驗結(jié)果陰性。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗 微核試驗結(jié)果見表4。

三葉白術(shù)湯口服液低、中、高劑量組小鼠微核發(fā)生率均低于4‰，均不超過微核自然發(fā)生率[7]，組間相互比較無顯著性差異(P>0.05)，證明三葉白術(shù)湯口服液低、中、高劑量組小鼠微核發(fā)生率未出現(xiàn)劑量依賴性升高；三葉白術(shù)湯口服液低、中、高劑量組與陰性對照組比較，也無顯著性差異(P>0.05)，可以判定試驗結(jié)果陰性?！笆榷嗳炯t細(xì)胞數(shù)/總紅細(xì)胞數(shù)”作為毒性指標(biāo)，各受試物組與陰性對照組比較，差異均不顯著(P>0.05)，表明在此研究試驗條件下，三葉白術(shù)湯口服液低、中、高劑量均沒有明顯骨髓紅細(xì)胞毒性。

組別劑量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三葉白術(shù)湯口服液898.00±12.17138.33±32.1547.00±17.0948.00±11.36177.00±12.12133.00±4.36251.00±51.10359.33±16.078.33±4.049.67±0.5840109.67±9.02148.67±11.5941.00±2.6550.67±3.06172.67±16.04145.33±12.50279.67±7.64379.67±16.296.67±3.066.67±1.5320089.00±8.19161.00±10.4451.33±12.2245.67±4.62186.33±8.33136.00±32.08300.33±45.00388.67±12.507.33±3.219.33±2.31100098.67±1.53172.67±14.1542.33±6.4347.33±3.06123.33±9.02147.67±15.18279.67±38.18370.00±14.935.67±2.527.67±3.06500078.33±10.50175.67±8.9640.00±24.5249.33±2.89114.00±23.81140.00±8.66259.33±46.69370.67±26.272.00±2.653.00±1.00陰性對照組89.00±10.54151.33±27.0643.67±3.2146.33±5.13146.33±9.07164.33±6.11253.33±8.14403.00±9.857.33±3.2111.33±7.57陽性對照組1092.00±156.18971.00±123.841030.33±157.071116.00±142.03889.33±104.64964.33±137.501235.33±103.50866.33±5.51236.00±3.46232.33±19.40

組別劑量(μg/皿)TA97aTA98TA100TA102TA1535-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9-S9+S9三葉白術(shù)湯口服液898.67±11.55108.33±7.6438.00±16.7034.67±3.21109.67±3.51145.67±4.04228.00±18.52289.00±61.4916.67±15.3110.33±6.6640105.00±14.42112.00±12.1243.33±1.5344.33±8.96140.00±4.36127.00±42.58271.00±8.72253.00±8.896.67±3.798.67±5.51200122.00±20.78143.33±35.8142.67±1.1539.33±2.08136.33±11.72102.33±5.86277.67±45.72286.33±30.9212.00±3.4622.33±14.571000124.67±8.14127.67±25.8136.33±5.5136.00±3.46116.67±16.77132.67±13.05260.33±25.54307.00±6.0810.33±4.0413.33±4.1615000106.00±8.72113.67±31.5042.67±6.8133.67±6.03143.00±11.00155.00±59.91309.33±11.06297.67±13.3216.00±18.5211.67±5.86陰性對照組100.67±5.0396.33±5.5147.00±1.7335.00±14.11144.00±11.27183.33±25.17311.00±10.00316.33±62.1716.33±17.2116.33±3.21陽性對照組932.67±231.73959.33±139.43974.67±125.87914.00±60.511329.00±13.00889.67±100.502545.67±288.27915.67±62.58360.67±86.64226.33±12.34

表3 三葉白術(shù)湯口服液致CHL染色體畸變試驗結(jié)果

注：一個細(xì)胞中出現(xiàn)2個或2個以上畸變類型，畸變細(xì)胞數(shù)計為1個；為了便于統(tǒng)計分析將空白對照組的劑量計為0 μg/mL。

*：與空白對照組相比，差異極顯著(P<0.01)

組別微核率(‰)嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/總紅細(xì)胞數(shù)陰性對照組1.58±1.320.60±0.10陽性對照組16.25±5.16**0.59±0.11藥物低劑量組1.50±1.050.59±0.09藥物中劑量組1.83±0.520.51±0.05藥物高劑量組1.58±1.280.56±0.07

**：與陰性對照組比較，P<0.01

3 討論

三葉白術(shù)湯口服液組方中的紫蘇、藿香、淡竹葉及白術(shù)四種植物“藥食兩用”已久，可見安全性。但三葉白術(shù)湯口服液需經(jīng)過毒性試驗對其安全性進行驗證。Ames試驗作為細(xì)菌回復(fù)突變試驗已被證明能檢出相關(guān)的遺傳學(xué)改變(移碼突變和堿基置換)和大部分嚙齒類動物遺傳毒性致癌劑[1]。因細(xì)菌作為原核生物不能完全檢測DNA損傷，所以又進行了哺乳動物細(xì)胞-中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞株(CHL)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目畸變的體外試驗。小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗作為遺傳損傷體內(nèi)試驗可提供一個包括影響受試物遺傳毒性作用的其他相關(guān)因素(吸收、分布、代謝、排泄)的試驗?zāi)Ｐ停梢粤硗鈾z出某些遺傳毒性物質(zhì)。此研究的三項遺傳毒性試驗是藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則推薦的標(biāo)準(zhǔn)組合：包括體內(nèi)和體外試驗，從原核到真核細(xì)胞，可以全面的檢測三葉白術(shù)湯口服液是否具有潛在的遺傳毒性。此研究的三項遺傳毒性試驗均為陰性，表明在此研究試驗條件下，三葉白術(shù)湯口服液無遺傳毒性。