王艷豐，張丁華，王書麗，劉守鉉，李愛心，桂啟勝

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院牧業(yè)工程學院，河南中牟451450 ； 2.河南省畜牧局，河南鄭州450002 ；3.河南豫正生物科技有限公司，河南中牟451450)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種豬的急性腸道傳染病，臨床特征為嘔吐、腹瀉、脫水和哺乳仔豬高死亡率。自2010年10月以來，PED在我國一直大面積暴發(fā)。2013年以后，PED暴發(fā)導致美國豬肉生產(chǎn)商每年損失9億至18億美元[1]，韓國40%的豬場受到影響，給生產(chǎn)者造成巨大經(jīng)濟損失[2]。

目前，對于PED尚無有效治療藥物，選擇合適的疫苗及合理的免疫程序是預防PED的重要措施。商品化的疫苗主要有豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗，豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗，豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗3種。但不同的疫苗對豬免疫效果會存在一定的差異，本試驗通過不同免疫程序?qū)ED黏膜免疫水平影響的研究，旨在探索該病的最佳免疫程序，為PED的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器與設備 全自動酶標儀；高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；4 ℃冰箱；超凈工作臺；5 mL、10 mL一次性注射器；微量移液器等。

1.1.2 主要試劑和疫苗 豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗(簡稱豬腹瀉二聯(lián)滅活苗);豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株，簡稱豬腹瀉三聯(lián)活疫苗)，均為市售正規(guī)疫苗；豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒，韓國安捷Bionote公司生產(chǎn)。

1.2 試驗豬場與試驗設計 2016年9月至2017年5月，選取河南省內(nèi)8個存欄母豬50～500頭的豬場，每個豬場母豬隨機分為2組(試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ)。免疫程序：2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗組(產(chǎn)前40 d、20 d)、2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗組(產(chǎn)前40 d、20 d)、2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗(產(chǎn)前60 d、40 d)+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗(產(chǎn)前20 d)組、1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗組(產(chǎn)前40 d)+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗(產(chǎn)前20 d)組。具體試驗分組與免疫程序見表1。試驗疫苗用法與用量：豬腹瀉二聯(lián)滅活疫苗，妊娠母豬于產(chǎn)前40 d、20 d后海穴各注射1次，每次4.0 mL；豬腹瀉三聯(lián)活疫苗，妊娠母豬于產(chǎn)前40 d、20 d后海穴各注射1次，每次1.0 mL。母豬產(chǎn)仔當天收集乳汁2 mL，用ELISA方法檢測初乳中IgA抗體值，最后取平均值。

表1 8個試驗豬場的分組與免疫程序

1.3 檢測指標與方法 按照PED IgA ELISA抗體檢測試劑盒說明書對所有試驗母豬初乳中PED IgA抗體進行檢測。(1)檢測的有效性：①陰性對照平均OD450/620nm值<0.200；②陽性對照平均OD450/620nm值>0.500，上述任何一個值超出規(guī)定的范圍，則該試驗被視為無效，所檢的樣品需要重新進行檢測；(2)計算判斷值：①用A1和B1孔的吸光值來計算陰性對照的平均OD450/620nm值，判斷值=(0.35+陰性對照的平均OD450/620nm值)；②根據(jù)陰性對照的OD450/620nm值，樣品結(jié)果的判斷標準如下：陽性結(jié)果：樣品OD450/620nm值>判斷值；陰性結(jié)果：樣品OD450/620nm值<判斷值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬場母豬乳汁中IgA抗體水平 對收集自河南省8個豬場接種過PED疫苗的母豬942份初乳樣品，利用PEDV IgA ELISA抗體檢測試劑盒進行檢測，結(jié)果顯示，不同地區(qū)豬場母豬初乳中PED IgA抗體檢測結(jié)果存在較大差異，以2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫組抗體水平最高，3組抗體陽性率均達到100%，豬腹瀉三聯(lián)活疫苗單獨或與豬腹瀉二聯(lián)滅活苗組合使用，抗體平均陽性率(97.79%)高于豬腹瀉二聯(lián)滅活苗組(90.69%)。采用相同免疫程序的豬場也存在較大差異，如2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗的8個豬場，抗體陽性率從85.71%至100%不等，1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗+1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗的2個豬場抗體陽性率分別為92.86%、93.06%，表明PED疫苗免疫效果會受到豬場飼養(yǎng)管理水平、營養(yǎng)、免疫程序、應激等諸多因素的影響。具體結(jié)果見表2。

2.2 不同免疫程序的IgA抗體陽性率與陽性平均OD值 免疫程序不同，初乳中IgA抗體與陽性平均OD值也不同?？贵w陽性率和陽性平均OD值最高的為2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫程序組，其次是2次豬腹瀉二聯(lián)活疫苗組，最低的為2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗組。具體結(jié)果見表3。

表2 不同豬場母豬乳汁中IgA抗體檢測結(jié)果

表3 不同免疫程序的IgA抗體陽性率與陽性平均OD值

3 討論

PEDV的免疫主要依靠黏膜免疫(SIgA)，研究表明，高水平的母源SIgA抗體與保護仔豬抵抗PEDV感染有關，而與血液中的中和抗體無相關性[3]。因此，如何刺激動物機體產(chǎn)生高效價的分泌型IgA抗體，是疫苗免疫以及PED防治的關鍵。

本試驗通過豬腹瀉二聯(lián)滅活苗、豬腹瀉三聯(lián)活疫苗的單獨及組合使用，不同免疫程序?qū)δ肛i初乳中IgA抗體水平影響的研究，結(jié)果表明，2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗的免疫效果最好，但成本相對于2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗偏高，其次是2次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗和1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗+1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗，這與王娟萍等[4]、劉從敏等[5]報道一致，最后是2次豬腹瀉二聯(lián)活疫苗，但胡興義等[6]報道單一接種豬腹瀉三聯(lián)活疫苗或豬腹瀉二聯(lián)滅活苗的免疫效果遠不如兩種疫苗交替接種的效果好。2014年前在我國各豬場使用的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗，使用的是經(jīng)典CV777株，免疫效果較好，但2015年以后防控效果有所下降，這可能與PEDV毒株發(fā)生變異，導致毒力增強有關[7- 8]。

研究表明，PEDV感染機體后，主要的靶器官是腸、腸系膜淋巴結(jié)和肺，且感染時間早、持續(xù)時間長，從而會導致消化器官嚴重的病理損傷[9]，因此，腸道黏膜免疫中SIgA抗體尤為重要。豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G5型)三聯(lián)活疫苗(弱毒華毒株+弱毒CV777株+NX株)于2015年后實現(xiàn)商品化上市，屬于弱毒疫苗。通過后海穴注射疫苗，尤其是弱毒活苗，可刺激母豬產(chǎn)生大量IgA抗體分泌到乳汁中形成SIgA抗體，從而為乳豬提供被動免疫保護[10]。

綜上所述，結(jié)合河南省實際情況和本研究結(jié)果，再考慮到疫苗費用，推薦豬場豬流行性腹瀉的免疫程序為：妊娠母豬產(chǎn)前40 d、20 d各免疫1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗，其所生仔豬3日齡時再免疫1次；或產(chǎn)前40 d、20 d分別免疫1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗和豬腹瀉二聯(lián)滅活苗。此外，妊娠母豬也可產(chǎn)前60 d、40 d各免疫1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗，產(chǎn)前20 d后海穴注射豬腹瀉二聯(lián)滅活苗或產(chǎn)前40 d、20 d各免疫1次豬腹瀉三聯(lián)活疫苗，同時肌肉注射豬腹瀉二聯(lián)滅活苗。同時，要注意加強對后備豬、種公豬及仔豬進行免疫。