焦 點(diǎn),孫 杰,茅愛華,俞正玉,郭容利,朱 琳,范寶超,袁萬哲,李 郁,何孔旺,李 彬

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014 ; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥230036 ;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071000)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED) 是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種腸道傳染病，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、消瘦和死亡,主要發(fā)病于冬春季。各年齡段的豬都會(huì)感染，哺乳仔豬尤為嚴(yán)重。該病1978年首次報(bào)道于比利時(shí)和英國，之后在我國多以散發(fā)為主[2]。從2010 年末開始，我國暴發(fā)以新生仔豬嚴(yán)重腹瀉、高發(fā)病率及高死亡率為主要特征的腹瀉疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2013 年美國也開始暴發(fā)仔豬腹瀉疫情，從遺傳進(jìn)化分析來看，美國的流行毒株與我國AH2012親緣關(guān)系接近，并出現(xiàn)了S-Indel型的新型缺失毒株。日本、加拿大、韓國等國也相繼暴發(fā)此病，盡管一些疫苗的應(yīng)用對(duì)該病的控制發(fā)揮了重要作用，但直至目前該疫情在部分地區(qū)仍然有不同程度的流行和發(fā)生。

PEDV屬于套式病毒目、冠狀病毒科、冠狀病毒屬I群的成員，基因組為單股正鏈RNA[8]。根據(jù)其他冠狀病毒的S蛋白可將其劃分為S1(第1～789位氨基酸)和S2(第790～1383位氨基酸)。S蛋白在與受體細(xì)胞結(jié)合吸附、膜融合和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體等方面發(fā)揮重要的作用[10-11]，因此分析PEDV S蛋白對(duì)于當(dāng)?shù)亓餍卸局甑牧餍星闆r和遺傳變異有重要意義。目前，在S基因鑒定出4個(gè)表位，分別為499 aa～638 aa、748 aa～755 aa、764 aa～771 aa、1 368 aa～1 374 aa[12-13]。本研究對(duì)江蘇部分豬場20份病料進(jìn)行PEDV的檢測，對(duì)S基因測序分析，為該病的防制提供了流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集 共20份組織樣品于2014-2016年采集于江蘇地區(qū)腹瀉發(fā)病豬場，病料樣品為不同日齡發(fā)病豬的腸道及糞便，采集后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器 Promega公司Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒; Abm公司Safe-Green 2xPCRTaqMaster Mix PCR試劑盒; BIOWEST公司AGAROSE G-10瓊脂糖凝膠；TaKaRa公司DS 2 000 DNA Marker；Omega公司Total RNA Kit II試劑盒； TaKaRa PCR Thermal Cycle Dice PCR儀；北京市六一儀器廠DYY-11型電泳儀；eppendorf (German)離心機(jī)；AXYGEN 膠回收試劑盒。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank已發(fā)表的PEDV的基因序列，設(shè)計(jì)如下4對(duì)引物，見表1，南京斯普金公司合成。

表1 設(shè)計(jì)的4對(duì)特異性引物

1.4 核酸模板的制備 取糞便或腸液，按1∶5用PBS稀釋后研磨，反復(fù)凍融3次，8 000 r/min離心10 min取上清，按照OMEGA Total RNA Kit II說明書提取病毒RNA，置于-70 ℃保存?zhèn)溆?。利用Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)總體積25 μL, 體系為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,DNA模板 2.0 μL,ddH2O 9.5 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入以下循環(huán)：95 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃ 1.5 min；共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，徹底延伸72 ℃ 10 min。取全部25 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增情況，并對(duì)陽性條帶切膠回收，連接pMD19-T克隆載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌送至南京思普金公司測序。

1.6 S基因序列分析 選取部分歐美、韓國、中國等地的參考毒株，毒株信息見表2，用DNA Star軟件對(duì)所獲得的20株P(guān)EDV S基因序列進(jìn)行拼接，使用軟件MegAlign進(jìn)行同源性分析，MEGA 5.0作遺傳進(jìn)化分析，繪制其遺傳進(jìn)化關(guān)系樹；用TMHMM Server,v.2在線軟件(http://www.cbs.dtu. dk/ services /THMM/)對(duì)PEDV S基因進(jìn)行跨膜區(qū)域預(yù)測。

表2 PEDV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 分別用4對(duì)引物對(duì)PEDV 的S基因進(jìn)行PCR分段擴(kuò)增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，可見到4條特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期結(jié)果相符，圖1。

圖1 PEDV S基因的4個(gè)片段分段擴(kuò)增

2.2 PEDV S基因同源性及N端氨基酸分析 20株毒株的核苷酸(氨基酸)同源性為95.1%～99.8% (94.6%～99.9%), 與我國流行毒株AH2012、疫苗毒株Attenuated DR13、歐美毒株CV777的同源性為95.5%～99.3%(94.6%～99.0%)、93.5%～96.0%(92.5%～96.3%)、93.6%～95.8%(93.0%～96.5%)。

所測20株毒株的氨基酸差異性主要集中于S1端，毒株JSCZ1601出現(xiàn)了特異性的缺失，與CV777相比，在58～59位缺失了2個(gè)氨基酸(SS)，見圖2。

圖2 毒株JSCZ1601 S基因編碼的氨基酸序列特異性變異位點(diǎn)分析

-:與參考毒株CV777氨基酸相同 ; .:缺失

2.3 S基因遺傳進(jìn)化分析 由圖3可知，PEDV毒株可分為2個(gè)大群(G1、G2)。12株流行野毒株位于G2b分支上，8株屬于G1群S-Indel型。G2群的毒株屬于流行毒株，和我國原先暴發(fā)的毒株(AH2012、AH2012/ 12、BJ-2011-1等)更為接近，其中韓國毒株獨(dú)自分為一個(gè)亞枝；G1毒株屬于經(jīng)典毒株，8株位于G1的毒株全部位于S-Indel基因缺失株亞群，與位于G1b群的疫苗(CV777、Attenuated DR13、JS2008等)毒株群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同時(shí)我國的S-Indel群毒株與美國S-Indel群毒株不在一個(gè)亞枝內(nèi)，說明我國的S-Indel基因缺失株與美國的S-Indel群毒株關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 基于S基因的遺傳進(jìn)化分析

▲:所測野毒株

2.4 抗原表位分析 對(duì)20株P(guān)EDV毒株S蛋白表位進(jìn)行分析，SS2和2C10相對(duì)保守，主要的變異位于COE區(qū)域和SS6。在COE區(qū)域共有21個(gè)氨基酸的點(diǎn)突變，包括A522 S、G525 D、S527G、S528G、V532I、F541I、D547N、T554S、F556S、S588G、L596F、G599S、D604N、G614V、L617 F、T618 V、T626 E，其中有3個(gè)位點(diǎn)突變成2個(gè)不一樣的氨基酸，包括K568R或N、A610E或者D、E638Q或者V，還有1個(gè)點(diǎn)突變位點(diǎn)變成3個(gè)不一樣的氨基酸 L526 H或P或R。SS6的點(diǎn)突變包括L764S或者Y、D766 Y、F或者S，見圖4。

圖4 野生株和參考株的S蛋白抗原表位的比較

-:與參考毒株CV777氨基酸相同

2.5 PEDV S基因跨膜區(qū)域變化 G2b流行株大部分在1 328～1 350位，而JSCZ1601在1 326～1 348位形成1個(gè)跨膜螺旋；S-Indel型毒株在1 325～1 347 位形成1個(gè)跨膜螺旋，主要是由于氨基酸的缺失或是插入使其跨膜螺旋區(qū)域發(fā)生了偏移，跨膜螺旋的偏移可能會(huì)造成病毒毒力的變化，影響機(jī)體對(duì)抗原位點(diǎn)的識(shí)別。

3 討論

PEDV是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一，其傳染性強(qiáng)、危害大，哺乳仔豬和育肥豬均能感染。2010年10月，中國南方暴發(fā)PED，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[14]。對(duì)S蛋白進(jìn)行基因變異分析，可在一定程度上反映PEDV的變異情況，本試驗(yàn)對(duì)PEDV陽性樣品S基因進(jìn)行克隆測序，分析近年來PEDV的變異情況，為PED的防控提供一定的科學(xué)依據(jù)。

對(duì)S基因序列分析結(jié)果可知，毒株JSCZ1601存在特異性的缺失，與CV777相比，在58～59位缺失了2個(gè)氨基酸(SS)，說明在PEDV的進(jìn)化演變過程中，突變是一種手段；此外，美國在2014年報(bào)道了S-Indel 毒株的存在，研究發(fā)現(xiàn)美國的S-Indel毒株USA/Iowa107/ 2013的S1段與CH/S最為接近，而S2段與CH/ZMZDY/11最為接近，說明存在一定的重組現(xiàn)象并出現(xiàn)了新型毒株。這次研究中發(fā)現(xiàn)，我國S-Indel毒株與美國S-Indel毒株處在一個(gè)亞群，但是不在一個(gè)小的分支里，說明我國的毒株同樣存在重組演變的過程，與美國的S-Indel型毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。我國毒株多屬于流行毒株G2群，美國的流行毒株單獨(dú)處于一個(gè)大的亞群，中國流行毒株同樣獨(dú)自形成一個(gè)亞群，說明同屬于G2群，但是親緣關(guān)系并不是很近；位于G1群的毒株都屬于S-Indel型，與疫苗毒株不在同一個(gè)分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

從抗原表位分析來看，突變位點(diǎn)主要集中于COE區(qū)域和SS6區(qū)域，同時(shí)跨膜螺旋區(qū)域的偏移，這些變異可能是導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)的原因，而變異導(dǎo)致病毒的致病機(jī)理變化還有待研究?？乖砦坏淖兓约翱缒ぢ菪齾^(qū)域的偏移，可能引起PEDV的免疫逃避機(jī)制，影響機(jī)體對(duì)抗原位點(diǎn)的識(shí)別，推測這可能是近些年來商品化疫苗保護(hù)效力降低的原因，開發(fā)新型疫苗具有重要意義。

本研究通過對(duì)PEDV S 基因測序分析，了解了當(dāng)前PEDV 變異毒株的流行情況，以及S基因的變異情況、突變位點(diǎn)、表位和膜螺旋區(qū)域的變化，為我國PEDV的防控提供基礎(chǔ)。