李幫濤 雷智賢 李虹艾 崔蘭 海元平 黃婷 向偉

570206?？?，海南省婦幼保健院（海南省兒童醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科（李幫濤、海元平、雷智賢、黃婷、向偉）；570206?？?，南華大學(xué)附屬海南醫(yī)院兒內(nèi)科（李虹艾）；570206?？?，海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒內(nèi)科（崔蘭）

腸道病毒 A71型（enterovirus A71，EV-A71）呈高度嗜神經(jīng)性，是引起重癥手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）的最主要病原體。重癥HFMD的發(fā)生機制非常復(fù)雜，其中兒茶酚胺類遞質(zhì)參與全身血管血流動力學(xué)變化，促進(jìn)重癥HFMD的進(jìn)展［1］。 β1-腎上腺素能受體（β1-adrenoceptor，β1-AR）是介導(dǎo)兒茶酚胺作用的重要組織受體，其中最具有功能性意義的β1-AR位點可能為G1165C位點［2］，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）的置換突變可能產(chǎn)生具有臨床意義的基因多態(tài)性。本研究對β1-AR基因編碼區(qū)1 165位進(jìn)行測序，探討該位點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與 EVA71感染的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 EV-A71感染組：2015年10月至2016年9月期間來自海南省婦幼保健院（海南省兒童醫(yī)院）117例臨床診斷為HFMD的患兒，其中EVA71感染77例，男性57例，女性20例，年齡2.3±1.2歲，其中輕癥HFMD 22例，重癥HFMD 55例，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合《HFMD診療指南（2010年版）》，經(jīng)實驗室檢測咽拭子的病毒核酸PCR（熒光標(biāo)記PCR法）陽性，或血清EV-A71 IgM抗體（北京萬泰ELISA法）陽性為入組標(biāo)準(zhǔn)，確診為EV-A71感染。健康對照組：同時期同地區(qū)我院門診健康體檢的兒童共66例，男性31例，女性35例，年齡2.9±1.1歲，且符合咽拭子的病毒核酸PCR和血清EVA71 IgM抗體陰性，無HFMD、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、嗜鉻細(xì)胞瘤、高血壓及心臟、腎臟疾病等病史，排除EV-A71感染。 兩組性別（χ2＝0.594，P ＝0.279）和年齡（t＝0.246，P＝0.130）比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：HFMD患兒急性期（病程前3 d內(nèi)）咽拭子標(biāo)本和靜脈EDTA抗凝血3 ml（基因檢測部分保存至-70℃冰箱）。

1.2.2 核酸檢測：選擇EV-A71 HFMD患兒77例和健康體檢兒童66例進(jìn)行核酸檢測。用OMEGA血樣DNA提取試劑盒（D3471-02）提取采集樣本的基因組 DNA。 依據(jù) NCBI發(fā)布的 β1-AR（GenBank序列號：NG＿012187.1）的編碼區(qū)序列設(shè)計擴增引物， Arg389Gly UP： 5′-CAGAAACATGCTGAAGT CCCG-3′， Arg389Gly DOWN： 5′-GATGGGCAGGAA GGACACC-3′。引物由上海蘭衛(wèi)檢驗公司合成。PCR擴增反應(yīng)總體系為25μl，其中10 × LAmp Buffer 2.5 μl，dNTP 2 μl，ADRB1-F1／F2／F3／F4 1 μl，ADRB1-R1 ／R2 ／R3／R4 1 μl，LAmp Taq 0.25 μl；5 ×C SolutionⅠ5 μl；DNA 模板1 μl，ddH2O 12.25 μl。 PCR 反應(yīng)條件：99 ℃ 10 min；99 ℃ 30 s，60 ℃45 s，72 ℃ 90 s，共38個循環(huán)；72 ℃ 7 min。 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序。將獲得的序列與NCBI ADRB1基因參考序列比對，確定SNP分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示，采用R?C表χ2檢驗比較，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP多態(tài)性分布的性別差異 從表1可看出，在男童中，EV-A71感染組和健康對照組C等位基因均占優(yōu)勢，但基因型頻率經(jīng)χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.135，df＝2，P ＝0.935）；等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.069， df＝1， P ＝0.868）。 在女童中，EVA71感染組和健康對照組C等位基因均占優(yōu)勢，但基因型頻率經(jīng)χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1.677，df＝2， P ＝0.432）；等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝0.866，df＝1，P＝0.380）。說明β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP基因型和等位基因無明顯的性別差異。

2.2 健康對照組和EV-A71感染組SNP多態(tài)性分布比較 從表1可看出，66名健康兒童和77例EVA71 HFMD患兒均存在 β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP，有3種基因型：GG、GC和CC。 在EVA71 HFMD患兒中，GG、GC和CC基因型頻率分別為10%、47%、43%，G、C等位基因頻率分別為34%、66%；在健康兒童中，GG、GC和CC基因型頻率分別為7%、41%、52%，G、C等位基因頻率分別為28%、72%。EV-A71感染組與健康對照組相比，基因型頻率經(jīng)χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1.154， df＝2， P ＝0.562）；等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝1.091，df＝1， P ＝0.296）。

表1 健康對照組和EV-A71感染組1 165位單核苷酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率的分布Tab.1 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in EV-A71 and control group infection

2.3 EV-A71感染輕癥組和重癥組SNP多態(tài)性分布比較 從表2可看出，按嚴(yán)重程度分組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，EV-A71感染輕癥組和重癥組相比，基因型頻率經(jīng)χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.945， df＝2，P ＝0.139）；等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗分析，分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝3.763，df＝2，P＝0.052）。說明β1-AR基因編碼區(qū)1 165位 SNP與EV-A71感染及其嚴(yán)重程度無關(guān)聯(lián)。

表2 EV-A71感染輕癥組和重癥組1 165位單核苷酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率的分布Tab.2 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in the mild and severe group of EV-A71 infection

3 討論

β1-AR基因已有多個SNP被識別，而G1165C位點是β1-AR基因編碼區(qū)的主要功能位點，目前國內(nèi)外學(xué)者針對β1-AR基因G1165C位點基因多態(tài)性的研究主要集中在心血管疾?。?-4］，與EV-A71感染的關(guān)系研究甚少。β1-AR核苷酸第1 165位核苷酸C被G替換，導(dǎo)致第389氨基酸由Gly變?yōu)锳rg，多項研究表明Arg389β1-AR的腺苷酸環(huán)化酶（AC）活性水平較 Gly389β1-AR 顯著升高［5-7］。 因此，結(jié)合EV-A71感染重癥HFMD的兒茶酚胺風(fēng)暴現(xiàn)象及G1165C位點的研究理論，理論上β1-AR G1165C位點的置換突變，參與G偶聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和L型通道的開放頻率，調(diào)節(jié)機體的生理功能，影響病情的嚴(yán)重程度。

由于遺傳背景差異（包括常染色體和性染色體），不同性別的位點基因多態(tài)性分布可能存在差異。王浩等［8］發(fā)現(xiàn)男性和女性不同基因型攜帶者之間的靜息心率存在統(tǒng)計學(xué)差異，β1-AR基因A145G位點可能與男性靜息心率相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)G1165C位點基因型和等位基因在EV-A71感染組和健康對照組的分布無統(tǒng)計學(xué)差異，可排除性別對β1-AR基因G1165C位點基因型分布的影響。本研究對77例EV-A71 HFMD患兒和66名健康對照者的β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP基因型進(jìn)行檢測和分析，發(fā)現(xiàn)兩組基因型和等位基因頻率的分布無統(tǒng)計學(xué)差異，且按病情嚴(yán)重程度分析，發(fā)現(xiàn)輕癥組和重癥組的分布亦無統(tǒng)計學(xué)差異。提示β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP與EV-A71感染及其嚴(yán)重程度無關(guān)聯(lián)，不會增加EV-A71感染和病情加重的風(fēng)險。分析原因可能為：①可能存在HFMD的其他易感基因或β-AR基因上的其他SNP，與β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP相互作用或連鎖不平衡。②EV-A71 HFMD的易感性不但受遺傳因素，可能還受到病毒毒力、環(huán)境影響，單個基因突變引起的作用較小。③研究樣本量偏小，且地區(qū)局限，可能對統(tǒng)計效能有一定影響。

因此在未來的研究中，應(yīng)加強多中心、多樣本研究β1-AR多態(tài)性位點，并關(guān)注與之存在連鎖不平衡以及相互作用的其他基因SNP位點，同時研究EVA71感染HFMD兒茶酚胺水平與β1-AR基因多態(tài)性的關(guān)系，深化對重癥HFMD發(fā)病機制的認(rèn)識，從基因水平為HFMD的防治提供新的研究思路。

利益沖突 無