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        β1-腎上腺素能受體基因編碼區(qū)1165位單核苷酸多態(tài)性與腸道病毒A71感染的關(guān)系

        2018-10-15 09:18:48李幫濤雷智賢李虹艾崔蘭海元平黃婷向偉
        關(guān)鍵詞:等位基因多態(tài)性基因型

        李幫濤 雷智賢 李虹艾 崔蘭 海元平 黃婷 向偉

        570206海口,海南省婦幼保健院(海南省兒童醫(yī)院)重癥醫(yī)學(xué)科(李幫濤、海元平、雷智賢、黃婷、向偉);570206???,南華大學(xué)附屬海南醫(yī)院兒內(nèi)科(李虹艾);570206海口,海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒內(nèi)科(崔蘭)

        腸道病毒 A71型(enterovirus A71,EV-A71)呈高度嗜神經(jīng)性,是引起重癥手足口?。╤and,foot and mouth disease,HFMD)的最主要病原體。重癥HFMD的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,其中兒茶酚胺類遞質(zhì)參與全身血管血流動力學(xué)變化,促進(jìn)重癥HFMD的進(jìn)展[1]。 β1-腎上腺素能受體(β1-adrenoceptor,β1-AR)是介導(dǎo)兒茶酚胺作用的重要組織受體,其中最具有功能性意義的β1-AR位點(diǎn)可能為G1165C位點(diǎn)[2],鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)的置換突變可能產(chǎn)生具有臨床意義的基因多態(tài)性。本研究對β1-AR基因編碼區(qū)1 165位進(jìn)行測序,探討該位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與 EVA71感染的關(guān)系。

        1 材料與方法

        1.1 研究對象 EV-A71感染組:2015年10月至2016年9月期間來自海南省婦幼保健院(海南省兒童醫(yī)院)117例臨床診斷為HFMD的患兒,其中EVA71感染77例,男性57例,女性20例,年齡2.3±1.2歲,其中輕癥HFMD 22例,重癥HFMD 55例,臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合《HFMD診療指南(2010年版)》,經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測咽拭子的病毒核酸PCR(熒光標(biāo)記PCR法)陽性,或血清EV-A71 IgM抗體(北京萬泰ELISA法)陽性為入組標(biāo)準(zhǔn),確診為EV-A71感染。健康對照組:同時期同地區(qū)我院門診健康體檢的兒童共66例,男性31例,女性35例,年齡2.9±1.1歲,且符合咽拭子的病毒核酸PCR和血清EVA71 IgM抗體陰性,無HFMD、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、嗜鉻細(xì)胞瘤、高血壓及心臟、腎臟疾病等病史,排除EV-A71感染。 兩組性別(χ2=0.594,P =0.279)和年齡(t=0.246,P=0.130)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)本采集:HFMD患兒急性期(病程前3 d內(nèi))咽拭子標(biāo)本和靜脈EDTA抗凝血3 ml(基因檢測部分保存至-70℃冰箱)。

        1.2.2 核酸檢測:選擇EV-A71 HFMD患兒77例和健康體檢兒童66例進(jìn)行核酸檢測。用OMEGA血樣DNA提取試劑盒(D3471-02)提取采集樣本的基因組 DNA。 依據(jù) NCBI發(fā)布的 β1-AR(GenBank序列號:NG_012187.1)的編碼區(qū)序列設(shè)計擴(kuò)增引物, Arg389Gly UP: 5′-CAGAAACATGCTGAAGT CCCG-3′, Arg389Gly DOWN: 5′-GATGGGCAGGAA GGACACC-3′。引物由上海蘭衛(wèi)檢驗(yàn)公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為25μl,其中10 × LAmp Buffer 2.5 μl,dNTP 2 μl,ADRB1-F1/F2/F3/F4 1 μl,ADRB1-R1 /R2 /R3/R4 1 μl,LAmp Taq 0.25 μl;5 ×C SolutionⅠ5 μl;DNA 模板1 μl,ddH2O 12.25 μl。 PCR 反應(yīng)條件:99 ℃ 10 min;99 ℃ 30 s,60 ℃45 s,72 ℃ 90 s,共38個循環(huán);72 ℃ 7 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序。將獲得的序列與NCBI ADRB1基因參考序列比對,確定SNP分型。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料以頻數(shù)或百分比表示,采用R?C表χ2檢驗(yàn)比較,P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 SNP多態(tài)性分布的性別差異 從表1可看出,在男童中,EV-A71感染組和健康對照組C等位基因均占優(yōu)勢,但基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.135,df=2,P =0.935);等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.069, df=1, P =0.868)。 在女童中,EVA71感染組和健康對照組C等位基因均占優(yōu)勢,但基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.677,df=2, P =0.432);等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.866,df=1,P=0.380)。說明β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP基因型和等位基因無明顯的性別差異。

        2.2 健康對照組和EV-A71感染組SNP多態(tài)性分布比較 從表1可看出,66名健康兒童和77例EVA71 HFMD患兒均存在 β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP,有3種基因型:GG、GC和CC。 在EVA71 HFMD患兒中,GG、GC和CC基因型頻率分別為10%、47%、43%,G、C等位基因頻率分別為34%、66%;在健康兒童中,GG、GC和CC基因型頻率分別為7%、41%、52%,G、C等位基因頻率分別為28%、72%。EV-A71感染組與健康對照組相比,基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.154, df=2, P =0.562);等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.091,df=1, P =0.296)。

        表1 健康對照組和EV-A71感染組1 165位單核苷酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率的分布Tab.1 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in EV-A71 and control group infection

        2.3 EV-A71感染輕癥組和重癥組SNP多態(tài)性分布比較 從表2可看出,按嚴(yán)重程度分組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),EV-A71感染輕癥組和重癥組相比,基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.945, df=2,P =0.139);等位基因頻率經(jīng) χ2檢驗(yàn)分析,分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.763,df=2,P=0.052)。說明β1-AR基因編碼區(qū)1 165位 SNP與EV-A71感染及其嚴(yán)重程度無關(guān)聯(lián)。

        表2 EV-A71感染輕癥組和重癥組1 165位單核苷酸多態(tài)性基因型和等位基因頻率的分布Tab.2 Distribution of single nucleotide polymorphism at locus 1 165 in the mild and severe group of EV-A71 infection

        3 討論

        β1-AR基因已有多個SNP被識別,而G1165C位點(diǎn)是β1-AR基因編碼區(qū)的主要功能位點(diǎn),目前國內(nèi)外學(xué)者針對β1-AR基因G1165C位點(diǎn)基因多態(tài)性的研究主要集中在心血管疾?。?-4],與EV-A71感染的關(guān)系研究甚少。β1-AR核苷酸第1 165位核苷酸C被G替換,導(dǎo)致第389氨基酸由Gly變?yōu)锳rg,多項(xiàng)研究表明Arg389β1-AR的腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性水平較 Gly389β1-AR 顯著升高[5-7]。 因此,結(jié)合EV-A71感染重癥HFMD的兒茶酚胺風(fēng)暴現(xiàn)象及G1165C位點(diǎn)的研究理論,理論上β1-AR G1165C位點(diǎn)的置換突變,參與G偶聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和L型通道的開放頻率,調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能,影響病情的嚴(yán)重程度。

        由于遺傳背景差異(包括常染色體和性染色體),不同性別的位點(diǎn)基因多態(tài)性分布可能存在差異。王浩等[8]發(fā)現(xiàn)男性和女性不同基因型攜帶者之間的靜息心率存在統(tǒng)計學(xué)差異,β1-AR基因A145G位點(diǎn)可能與男性靜息心率相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)G1165C位點(diǎn)基因型和等位基因在EV-A71感染組和健康對照組的分布無統(tǒng)計學(xué)差異,可排除性別對β1-AR基因G1165C位點(diǎn)基因型分布的影響。本研究對77例EV-A71 HFMD患兒和66名健康對照者的β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP基因型進(jìn)行檢測和分析,發(fā)現(xiàn)兩組基因型和等位基因頻率的分布無統(tǒng)計學(xué)差異,且按病情嚴(yán)重程度分析,發(fā)現(xiàn)輕癥組和重癥組的分布亦無統(tǒng)計學(xué)差異。提示β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP與EV-A71感染及其嚴(yán)重程度無關(guān)聯(lián),不會增加EV-A71感染和病情加重的風(fēng)險。分析原因可能為:①可能存在HFMD的其他易感基因或β-AR基因上的其他SNP,與β1-AR基因編碼區(qū)1 165位SNP相互作用或連鎖不平衡。②EV-A71 HFMD的易感性不但受遺傳因素,可能還受到病毒毒力、環(huán)境影響,單個基因突變引起的作用較小。③研究樣本量偏小,且地區(qū)局限,可能對統(tǒng)計效能有一定影響。

        因此在未來的研究中,應(yīng)加強(qiáng)多中心、多樣本研究β1-AR多態(tài)性位點(diǎn),并關(guān)注與之存在連鎖不平衡以及相互作用的其他基因SNP位點(diǎn),同時研究EVA71感染HFMD兒茶酚胺水平與β1-AR基因多態(tài)性的關(guān)系,深化對重癥HFMD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識,從基因水平為HFMD的防治提供新的研究思路。

        利益沖突 無

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