余軍 楊文彬 楊憲普 帥旗 趙越 張赟 朱實(shí)惠 蔣正東 吳建華 趙靜付建林

225300泰州，江蘇金迪克生物技術(shù)有限公司

中國(guó)是流感高發(fā)地區(qū)［1-2］，自1957年以來(lái)中國(guó)大陸和香港發(fā)生了幾次流感大流行，其病毒株也源于兩地［3-6］。流感和并發(fā)性肺炎在成人（≥40歲）死亡的主要原因中排名第四［7］。流感在老年人群中可引起高致病率和高病死率，隨著年齡增長(zhǎng)，尤其70歲以上，除了由急性流感和繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎造成的死亡外，流感還可增加缺血性心臟病、腦血管疾病、糖尿病人群的住院率和死亡率［8］。由于老年人免疫力低下，現(xiàn)有的流感疫苗對(duì)老年人的保護(hù)不力，疫苗效力低于青壯年（分別為68.6%和74%）［9］。疫苗免疫效力可能只有健康成人的60%并且效力隨著年齡增加及免疫力衰退的加劇而下降［8］。由于目前中國(guó)擁有世界上最大的老年人口（＞8 000萬(wàn)），今后隨老年人口繼續(xù)增加，流感流行將造成更大的健康危害和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［10］。

目前世界上只有高劑量的三價(jià)疫苗和加佐劑標(biāo)準(zhǔn)劑量疫苗應(yīng)用于≥65歲老年人群［11］，它們?nèi)狈?duì)另一譜系的B型流感病毒的預(yù)防，需要提供新型高劑量流感疫苗和新的接種方式以增加免疫原性并提供更多保護(hù)。國(guó)外迄今還沒(méi)有四價(jià)老年流感疫苗，國(guó)內(nèi)尚無(wú)任何老年流感疫苗。本研究的目的是在本公司研發(fā)的四價(jià)流感病毒裂解疫苗的基礎(chǔ)上研制適用于老年高危群體的安全有效的流感疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 流感疫苗：采用2016—2017年流感季W(wǎng)HO推薦疫苗株：A1（A／California／7／2009，H1N1）、A3（A／Hong Kong／4801／2014）、B1（B／Brisbane／60／2008，B／Victoria）和 B2（B／Phuket／3073／2013，B／Yamagata），從英國(guó)國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所（NIBSC）引進(jìn)。采用本公司研制并經(jīng)檢定合格的流感病毒疫苗單價(jià)原液分別配制成標(biāo)準(zhǔn)劑量和高劑量試驗(yàn)動(dòng)物用疫苗（具體免疫劑量的計(jì)算參見(jiàn)2.2）。第一、二批試驗(yàn)所用四型單價(jià)原液批號(hào)分別為：YA120161001（HA 含量 190 μg／ml）、YA320161001（HA 含量 286 μg／ml）、YB120161001（HA 含量 129 μg／ml）和 YB220161001（HA 含量 112 μg／ml）；第三批試驗(yàn)所用四型單價(jià)原液批號(hào)分別為：YA120161003（HA 含量 231 μg／ml）、YA320161003（HA 含量 445 μg／ml）、YB120161003（HA 含量 251 μg／ml）和 YB220161003（HA 含量 286 μg／ml）；標(biāo)準(zhǔn)劑量?jī)舍樤囼?yàn)所用四型單價(jià)原液批號(hào)分別為：YA120170601（HA 含量 199 μg／ml）、YA320170601（HA 含量 273 μg／ml）、YB120170601（HA 含量 106 μg／ml）、YB220170601（HA 含量 277 μg／ml）。

1.1.2 主要試劑及儀器：A1（H1N1）、A3（H3N2）、B1（B／Victoria）和 B2（B／Yamagata）流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原參考品、標(biāo)準(zhǔn)抗體參考品均來(lái)源于NIBSC；霍亂濾液購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；氯化鈉等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品；三用電熱恒溫水箱購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)為SHHW21-420；純水儀Milli-Q低熱原型購(gòu)自法國(guó)Millipore公司，型號(hào)為A10；漩渦震蕩儀購(gòu)自IKA公司，型號(hào)為V2S025；臺(tái)式低速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)為L(zhǎng)500；數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)為KQ5200DE。

1.2 免疫原性試驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)KM小鼠，18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分組，每籠5～6只。

1.2.2 免疫劑量：近年來(lái)新藥藥效研究中多以以下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量：

其中D為藥物劑量，K為常數(shù)，W為動(dòng)物體重（Kg），人及不同種類(lèi)動(dòng)物的K值不同，如人10.6、小鼠9.1［12］。根據(jù)以上給藥公式及現(xiàn)在市場(chǎng)上常規(guī)注射流感疫苗的血凝素含量15μg／株／劑。計(jì)算小鼠標(biāo)準(zhǔn)劑量肌肉注射流感疫苗血凝素含量應(yīng)為4.5μg／株／劑［13］。

本試驗(yàn)使用的高劑量流感疫苗每株血凝素的濃度為18μg／株／劑是標(biāo)準(zhǔn)劑量的4倍［14］。將單價(jià)原液分別配制為高劑量、標(biāo)準(zhǔn)劑量四價(jià)流感病毒裂解疫苗和高劑量、標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗，其中A苗含A1和A3型血凝素高劑量為各18μg／株／劑，標(biāo)準(zhǔn)劑量為各4.5μg／株／劑，B苗含B1和B2型血凝素高劑量為各18μg／株／劑，標(biāo)準(zhǔn)劑量為各4.5μg／株／劑，并分兩次接種小鼠，下文中均根據(jù)A＋B套苗接種先后順序稱(chēng)為先A苗后B苗或先B苗后A苗。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 免疫劑量及次數(shù)試驗(yàn)分組：將小鼠隨機(jī)分為7組，試驗(yàn)組每組12只以上，分別為：高劑量單次免疫組、高劑量先A苗后B苗組、高劑量先B苗組后A苗組、標(biāo)準(zhǔn)劑量單次免疫組、標(biāo)準(zhǔn)劑量先A苗后B苗組、標(biāo)準(zhǔn)劑量先B苗后A苗組及PBS對(duì)照組。重復(fù)3次。

1.2.3.2 高劑量二針間隔時(shí)間選擇試驗(yàn)分組：將小鼠隨機(jī)分為9組，分別為：先A苗后B苗間隔3 d組、7 d組和10 d組；先B苗后A苗間隔3 d組、7 d組和10 d組。其中試驗(yàn)組每組15只，對(duì)照組每組5只。

1.2.3.3 免疫方法和采血時(shí)間：每只小鼠經(jīng)后腿肌肉注射，注射量控制在0.25 ml以?xún)?nèi)。兩次免疫的小鼠，免疫間隔均為7 d。單次免疫和第二次免疫后21 d，小鼠眼眶采血，分離血清，置-20℃保存待測(cè)。1.2.4 血凝抑制試驗(yàn)：每份血清經(jīng)霍亂濾液處理，進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，測(cè)定其抗體滴度。血凝抑制試驗(yàn)使用來(lái)自NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)血清以確定和配制血凝抑制試驗(yàn)中所使用的四個(gè)血凝單位的抗原濃度。采用微量半加敏法測(cè)定每份小鼠血清的抗血凝素抗體滴度。

1.2.5 免疫原性的判定：抗體滴度為采用血凝抑制法（HI）測(cè)定血清中對(duì)所有的原型病毒株的抗血凝素抗體，以達(dá)到完全抑制凝集最高稀釋度的倒數(shù)表示。同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性和陰性血清的參考標(biāo)準(zhǔn)。血凝抑制效價(jià)≥40，判為陽(yáng)性血清；效價(jià) ＜40，為陰性血清［13］。

表1 不同免疫劑量及次數(shù)試驗(yàn)陽(yáng)轉(zhuǎn)率Tab.1 Seroconversion rate of the assay of immunization dose and frequency

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)各組小鼠血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率及血凝抑制抗體幾何平均滴度（HI GMT）［3］。血凝抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均幾何滴度±標(biāo)準(zhǔn)差表示。為便于計(jì)算，任何 HI＜10表示為5［13］。 運(yùn)用 SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann Whitney test檢驗(yàn)對(duì)抗體水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為顯著性差異?！?”表示P＜0.05，“??”表示P＜0.01，“???”表示 P ＜0.001。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定動(dòng)物免疫后血清中抗血凝素抗體滴度，并計(jì)算血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率和抗血凝素抗體幾何平均滴度。

2.1 比較動(dòng)物接種不同劑量次數(shù)、陽(yáng)轉(zhuǎn)率和抗血凝素抗體 測(cè)定7組共261份小鼠血清的抗血凝素抗體滴度。

2.1.1 計(jì)算各組陽(yáng)轉(zhuǎn)率：除高劑量組、標(biāo)準(zhǔn)劑量組和PBS組的單次注射組外，其余先A苗后B苗組、先B苗后 A苗組均為兩針注射，間隔7 d，重復(fù)3次。

表1結(jié)果顯示，高劑量單次免疫組和高劑量A＋B套苗組免疫動(dòng)物血清中抗各種血凝素抗體均呈現(xiàn)高的陽(yáng)轉(zhuǎn)率。高劑量單次免疫組血清中抗各種血凝素抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)劑量的單次免疫組，A3型除外。高劑量A＋B套苗組血清中抗各種血凝素抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率與標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗組陽(yáng)轉(zhuǎn)率相近似，高劑量A＋B套苗組血清中抗B1型血凝素抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗組。無(wú)論是高劑量還是標(biāo)準(zhǔn)劑量，兩次免疫組陽(yáng)轉(zhuǎn)率均高于單次免疫組。整體表明，高劑量組血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)劑量組，兩次免疫組優(yōu)于單次免疫組。

2.1.2 高劑量和標(biāo)準(zhǔn)劑量單次免疫動(dòng)物后抗血凝素抗體反應(yīng)：對(duì)單次免疫時(shí)高劑量與標(biāo)準(zhǔn)劑量組抗血凝素抗體滴度比較顯示（表2），高劑量單次免疫組抗各種血凝素抗體滴度均高于標(biāo)準(zhǔn)劑量單次免疫組，特別是 A1、B1和 B2（P ＜0.001），PBS組無(wú)抗血凝素抗體產(chǎn)生。

2.1.3 比較A＋B套苗免疫后動(dòng)物抗體反應(yīng)

2.1.3.1 比較標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗免疫后動(dòng)物抗體反應(yīng)：先A苗后B苗組或先B苗A苗組，進(jìn)行兩次免疫，間隔7 d。

表3結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗無(wú)論是先A苗后B苗組，還是先B苗后A苗組，各中抗血凝素抗體滴度均高于表2中標(biāo)準(zhǔn)劑量單次免疫組。

2.1.3.2 比較高劑量A＋B套苗免疫動(dòng)物后抗體反應(yīng)：無(wú)論是高劑量組中（表2和表4）還是在標(biāo)準(zhǔn)劑量組中（表2和表3），在免疫總劑量相同時(shí)，A＋B套苗兩次免疫的效果優(yōu)于單次免疫。

表2 單次免疫高劑量組與標(biāo)準(zhǔn)劑量組免疫后抗血凝素抗體滴度比較Tab.2 Comparison of the HI titers of one high and standard dose groups

表3 標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗兩次免疫組抗血凝素抗體滴度比較Tab.3 Comparison of the HI titers of standard dose A＋B serial vaccine groups

表3和表4中有更令人注意的一致性結(jié)果：高劑量A＋B套苗和標(biāo)準(zhǔn)劑量A＋B套苗如采取先A苗后B苗的免疫方式，其抗B1和B2的血凝素抗體滴度高于先B苗后A苗組中的抗B1和B2的血凝素抗體滴度；反之，如采取先B苗后A苗的免疫方式，其抗A1和A3型血凝素抗體滴度高于先A苗后B苗組的抗A1和A3型血凝素抗體滴度。除高劑量先A苗后B苗組抗B1型血凝素抗體滴度與先B苗后A苗組抗B1型血凝素抗體滴度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組相應(yīng)型別的抗血凝素抗體滴度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 高劑量A＋B套苗免疫兩次的時(shí)間選擇 為了進(jìn)一步探究A＋B套苗兩次免疫的間隔時(shí)間對(duì)抗體產(chǎn)生的影響，設(shè)高劑量單次免疫組、先A苗后B苗組、先B苗A苗組為實(shí)驗(yàn)組，PBS對(duì)照組，試驗(yàn)組動(dòng)物總數(shù)為15只，對(duì)照組為5只，測(cè)其單次免疫和間隔3 d、7d和10 d兩次免疫的小鼠血清中的抗血凝素抗體滴度和陽(yáng)轉(zhuǎn)率。

表4 高劑量A＋B套苗兩次免疫組抗血凝素抗體滴度比較Tab.4 Comparison of the HI titers of HD A＋B serial vaccine groups

本次試驗(yàn)高劑量單次免疫組和先A苗后B苗組、先B苗后A苗組免疫最終血凝素總含量都為72μg。

學(xué)科核心素養(yǎng)是學(xué)科育人的集中體現(xiàn)，是學(xué)生通過(guò)學(xué)科學(xué)習(xí)而逐步形成的正確價(jià)值觀念、必備品格和關(guān)鍵能力。語(yǔ)文學(xué)科核心素養(yǎng)是學(xué)生在積極的語(yǔ)言實(shí)踐活動(dòng)中積累與構(gòu)建起來(lái)，并在真實(shí)的語(yǔ)言運(yùn)用情境中表現(xiàn)出來(lái)的語(yǔ)言能力及其品質(zhì)；是學(xué)生在語(yǔ)文學(xué)習(xí)中獲得的語(yǔ)言知識(shí)與語(yǔ)言能力，思維方法與思維品質(zhì)，情感、態(tài)度與價(jià)值觀的綜合體現(xiàn)。主要包括“語(yǔ)言建構(gòu)與運(yùn)用”“思維發(fā)展與提升”“審美鑒賞與創(chuàng)造”“文化傳承與理解”四個(gè)方面。那么，如何通過(guò)語(yǔ)文教學(xué)提升學(xué)生的語(yǔ)文學(xué)科素養(yǎng)呢？筆者認(rèn)為，閱讀和表達(dá)能力的培養(yǎng)是提升學(xué)生語(yǔ)文學(xué)科素養(yǎng)的根本途徑和基本手段。

從表5可見(jiàn)，當(dāng)先接種B苗，隔7 d再接種A苗時(shí)，除對(duì)A3和B1型抗原的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率為93.33%外，其他各組對(duì)四型抗原的血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率均為100%。該結(jié)果表明，兩次免疫的間隔時(shí)間及免疫先后順序?qū)＋B套苗血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響沒(méi)有顯著差異。

表5 高劑量A＋B套苗兩次免疫間隔時(shí)間和陽(yáng)轉(zhuǎn)率Tab.5 Seroconversion rate of the immunization intervals of HD A＋B serial vaccine

兩次免疫時(shí)間間隔的選擇是以抗血凝素抗體滴度的高低來(lái)確定最優(yōu)免疫時(shí)間間隔。測(cè)定一次高劑量和兩次高劑量A＋B套苗分別間隔3、7、10 d的抗血凝素抗體滴度，見(jiàn)表6。

從表6可見(jiàn)，高劑量A＋B套苗組和高劑量的單次免疫組所使用的血凝素總劑量相同，在高劑量A＋B套苗組，兩次免疫間隔3、7、10 d的動(dòng)物血清抗血凝素抗體滴度高于高劑量單次免疫。高劑量A＋B套苗7 d和10 d組的各項(xiàng)抗血凝素抗體滴度均高于3 d組。同時(shí)再次證實(shí)，與表2和表3中的結(jié)果一致。先A苗后B苗組中，抗B型血凝素抗體滴度增加顯著；先B苗后A苗組中，抗A型血凝素抗體滴度明顯增加，P＜0.001。

表6 高劑量A＋B套苗免疫間隔時(shí)間對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生抗血凝素抗體滴度的比較Tab.6 The effect of immunization intervals on the immunogenicity of different antigens

3 討論

每年都有A型和B型流感病毒引起的季節(jié)性流感，特別是老年人群易受流感病毒感染，造成高發(fā)病率和病死率。流感疫苗是預(yù)防季節(jié)性流感的最佳手段，但是我國(guó)老年人群接種疫苗的比例不足僅5%。因?yàn)槔夏耆嗣庖吡Φ拖?、免疫反?yīng)較差［15］，傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)流感疫苗對(duì)老年人群的保護(hù)力不夠，并隨著年齡增加而下降。因此需要研制更有效的疫苗。有臨床研究證明，提高疫苗中流感血凝素含量的高劑量疫苗可在老年人群中誘導(dǎo)比標(biāo)準(zhǔn)劑量疫苗更高的免疫反應(yīng)［8］。目前國(guó)外沒(méi)有四價(jià)高劑量老年流感疫苗，國(guó)內(nèi)尚無(wú)任何老年流感疫苗。

賽諾菲公司進(jìn)行的高劑量三價(jià)流感疫苗Fluzone 的研究表明［11，16］，高劑量 Fluzone 在65 歲以上老年群體中預(yù)防流感時(shí)，比標(biāo)準(zhǔn)劑量Fluzone更有效，產(chǎn)生的血清抗體滴度顯著高于標(biāo)準(zhǔn)劑量Fluzone，是安全性的。高劑量的三價(jià)Fluzone疫苗每針劑中每株血凝素含量為60μg，總血凝素含量為180μg；標(biāo)準(zhǔn)劑量的三價(jià)Fluzone疫苗每針劑中每株血凝素含量為15μg，總血凝素含量為45μg。賽諾菲高劑量三價(jià)Fluzone疫苗是2009年12月獲得FDA批準(zhǔn)上市，由Glaxo Smith Kline公司生產(chǎn)四價(jià)流感疫苗Fluarix于2012年7月20日經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市［17］。歷經(jīng)多年，并無(wú)高劑量四價(jià)流感疫苗出現(xiàn)，其原因可能是，若按高劑量三價(jià)流感疫苗的配方，每劑四價(jià)高劑量的流感疫苗，每株病毒血凝素含量為60μg，其總血凝素含量高達(dá)240μg。隨著血凝素含量的增加可以推測(cè)其注射后副反應(yīng)相應(yīng)增加。因此，本研究設(shè)計(jì)老年高劑量四價(jià)流感疫苗A＋B套苗，將疫苗分為A苗和B苗，分兩次免疫，如用于人群免疫，每次總血凝素含量不超過(guò)120μg，低于高劑量三價(jià)疫苗血凝素總量，其注射后免疫反應(yīng)應(yīng)隨之減少而更安全。當(dāng)然，對(duì)于已有高劑量三價(jià)流感疫苗，是否可以通過(guò)增加注射一次高劑量另一B型血凝素達(dá)到加強(qiáng)免疫反應(yīng)還有待驗(yàn)證，也不失為一種研制老年流感疫苗的新途徑。

高劑量A＋B套苗中高血凝素含量可增加疫苗免疫原性，誘生更高水平的抗血凝素抗體。高劑量的A＋B套苗如果采用先A苗后B苗的免疫方式，其抗B1和B2型的血凝素抗體滴度高于先B苗后A苗組；反之，如先B苗后A苗的免疫方式，其抗A1和A3型的血凝素抗體滴度高于先A苗后B苗組。同樣的結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)劑量的A＋B套苗組等試驗(yàn)中證實(shí)。因此，可根據(jù)當(dāng)年對(duì)A型和B型流感病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，選擇或改變使用先A苗后B苗或者是先B苗后A苗的免疫順序，增加疫苗的保護(hù)效果。

免疫間隔時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果則再次證明了高劑量A＋B套苗相對(duì)于高劑量單次免疫疫苗在免疫原性方面的顯著優(yōu)越性，間隔7 d和10 d的免疫反應(yīng)優(yōu)于間隔3 d，原因是流感病毒A型和B型抗原間存在共同抗原［18］，在第2次免疫對(duì)共同抗原產(chǎn)生更高的免疫應(yīng)答，提供第2次免疫時(shí)間可靈活選擇7～10 d。

本研究研發(fā)高劑量四價(jià)流感A＋B套苗，為免疫力低下、對(duì)高劑量疫苗的副反應(yīng)耐受性差的高危老年人群提供一種安全有效、新型老年流感疫苗和免疫模式。

利益沖突 無(wú)