胡秀榮 黃振東 蒲占湑 杜丹超 陳國慶 鹿連明

（浙江省柑橘研究所 臺州318026）

柑橘黑點病在浙江柑橘產(chǎn)區(qū)經(jīng)常發(fā)生，嚴重影響果實外觀品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失，是當(dāng)前柑橘重點防治的對象。目前生產(chǎn)上防治黑點病主要以代森錳鋅為主，一年噴藥4～5次，由于該藥劑多年連續(xù)使用，再加上農(nóng)戶噴藥過程中經(jīng)常隨意加大用藥濃度，勢必造成農(nóng)藥的殘留和環(huán)境的污染，因而開發(fā)低殘留、對環(huán)境友好的生物農(nóng)藥很有必要，本研究試圖從浙江大陳島海域采樣分離微生物，從中篩選出具有拮抗活性的菌株，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海洋微生物的分離

1.1.1 樣品的采集。為排除陸地微生物的干擾，從遠離大陸的大陳島（下大陳島）周邊海域取樣，樣品包括新出海的魚類、貝類、蝦類以及潮間帶的泥沙，將采集的樣品放入裝有冰塊的保溫箱，24h 內(nèi)帶回實驗室內(nèi)進行微生物的分離[1]。

1.1.2 分離培養(yǎng)基。共選用5種分離培養(yǎng)基，成分如下：G1：可溶性淀粉20g，KNO31.0g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NaCl0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，人工海水1000ml；M1：葡 萄 糖10g；天 冬 氨 酸0.5g；K2HPO40.5g；MgSO4·7H2O0.05g；瓊脂20g；人工海水1000ml；M2：瓊脂20g；人工海水1000ml；PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，人工海水1000ml；NA：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，瓊脂20g，人工海水1000ml。

其中人工海水是采用Sigma 公司生產(chǎn)的海鹽40g加入1000ml 的純凈水溶解而成。G1、M1和M2三種培養(yǎng)基中均加入萘啶酮酸15μg/ml、制霉菌素50μg/ml和放線菌酮50μg/ml[3]。

1.1.3 海洋微生物的分離與培養(yǎng)。將采集魚類、貝類和蝦類的樣品用無菌剪刀剪碎，取1g樣品，放入4ml的無菌水中，55℃熱激10min，劇烈搖動，再將樣品1:4稀釋，取20μL 稀釋液均勻涂布于5種分離培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2～6周，待菌落長出，挑取菌落進行轉(zhuǎn)接純化，純化培養(yǎng)的菌株再接種到含分離培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹2]。

1.2 拮抗菌株的篩選

1.2.1 指示菌平板的制備。柑橘黑點病菌由本實驗室從發(fā)病的柑橘果實上分離并保存。將保存的柑橘黑點病菌轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落長滿整個培養(yǎng)皿，用直徑6mm的打孔器打取菌餅，置入PDA 培養(yǎng)基平板中央即為指示菌平板。

1.2.2 拮抗菌株的篩選 。采用對峙培養(yǎng)的方法篩選拮抗菌株，將分離獲得的海洋放線菌、真菌和細菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7d后，在有菌生長處用打孔器取直徑6mm的菌餅，置于距離指示菌平板中心約3cm處，每皿成三角形放置3塊，以不放置待測菌株的指示菌平板作為對照。于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d后，觀察抑菌帶的有無和寬度，據(jù)此判定微生物的拮抗活性[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋微生物的分離

從浙江省大陳島周邊海域采集魚類、貝類、蝦類以及潮間帶的泥沙等樣品20份，進行海洋微生物菌株分離。根據(jù)菌落生長形態(tài)、大小、色澤等特點進行重排，用肉眼觀察，從平板上挑取不同生長特征的菌落進行純培養(yǎng)，分離到形態(tài)特征各異的菌株共計57株。其中放線菌28株、真菌16株、細菌13株（表1）。

2.2 拮抗菌株的初篩

通過平板對峙培養(yǎng)試驗，從分離獲得的微生物中篩選出4株對柑橘黑點病菌具有明顯拮抗活性的菌株（圖1所示）。4株菌均屬

表1 不同海洋生物樣品中分離的菌株數(shù)

圖1 拮抗柑橘黑點病菌的菌株

于放線菌，分離獲得的其他16株真菌和13細菌中未發(fā)現(xiàn)拮抗活性的菌株。

3 討論

海洋中有大量微生物資源，其低溫、高壓、高鹽的特殊環(huán)境為抗生素等多種代謝活性產(chǎn)物的產(chǎn)生提供了可能，海洋微生物資源的發(fā)利用前景廣闊，是當(dāng)前海洋學(xué)和微生物學(xué)研究的熱點[3]。海洋放線菌，尤其是鏈霉菌在海洋環(huán)境中分布廣泛，種類多樣，能產(chǎn)生多種抗生素類物質(zhì)，具有巨大的研究開發(fā)價值。

本研究從浙江省大陳島海域采集的海洋生物和泥沙等20份樣品中分離獲得了57株微生物菌株，經(jīng)初步測定得知其中有4株放線菌對柑橘黑點病菌具拮抗活性。本次研究結(jié)果表明臺州地區(qū)海洋環(huán)境中含有對柑橘病原菌具拮抗活性的微生物，可作為今后拮抗微生物獲取的重要來源。本研究測定4株放線菌對柑橘黑點病病菌均具有抑菌活性，那么這些菌株對其他植物病原菌是否有拮抗活性，以及其他分離的微生物對柑橘黑點病菌外的植物病原菌是否有拮抗活性，仍需進一步研究確定。此外，對這些拮抗菌株的分類鑒定等也是接下來需要開展的工作。