黃 麗，孫傳孔，彭若冰，劉志明，毛甜甜，彭友儉

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060)

干燥綜合征屬于一種慢性炎癥性自身免疫性疾病, 其發(fā)病機制尚不明確，病變常累及唾液腺等部位[1]。細胞間黏附分子-1(ICAM-1)參與免疫反應(yīng)的發(fā)生及自身免疫的全過程，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病中存在高表達[2]。多聚免疫球蛋白受體(pIgR) 為免疫球蛋白超家族中的一員, 是多聚免疫球蛋白A(pIgA) 和多聚免疫球蛋白M(pIgM) 的特異性受體[3-4]。目前針對ICAM-1和pIgR與干燥綜合征關(guān)系的研究報道尚少。本研究旨在通過觀察ICAM-1、pIgR在干燥綜合征患者唾液腺上皮細胞中的表達情況，初步探討ICAM-1、pIgR在干燥綜合征發(fā)病中的作用。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇我院2016年9月—2017年3月收治的干燥綜合征患者50例為研究組，均符合干燥綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并腫瘤及心、腦等重要器官疾病者。其中男30例，女20例；年齡26～67 (38.2±2.1)歲。同時選擇40例年齡、性別與研究組相匹配的健康體檢者為對照組，男24例，女16例；年齡27～66 (37.8±1.6)歲。2組受試對象均自愿參加研究，并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2研究方法

1.2.1唾液腺組織上皮細胞的收集及培養(yǎng) 在局部麻醉下,從受試對象的下唇黏膜處取出微小的唾液腺組織, 運用無菌磷酸緩沖液沖洗3次，切割成 1 mm3大小的小塊。然后將每小塊組織置于含有氫化可的松、青霉素、 鏈霉素、牛腦垂體提取物等無血清培養(yǎng)基中, 并于37 ℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的唾液上皮細胞達到90 %融合后用于實驗。

1.2.2ICAM-1、pIgR mRNA表達檢測 采用RT-PCR法測定。以TRIzol試劑提取唾液腺上皮細胞中的總RNA。采用TAKAR公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用提取和RNA來進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA樣品用PCR儀進行PCR擴增反應(yīng)。引物設(shè)計由上海吉然生物科技有限公司完成。PCR擴增條件:首先94 ℃ 4 min 變性,繼之94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環(huán),最后延伸72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀采集照片并進行掃描，以β-actin為內(nèi)參，分析ICAM-1、pIgR mRNA表達水平。

1.2.3ICAM-1、pIgR蛋白表達檢測 采用鏈親和素-生物素-免疫過氧化物酶法對唾液腺冰凍切片進行免疫組化分析。冰凍切片采用丙酮固定，加入鼠抗人pIgR或ICAM-1 單抗,在4 ℃條件下過夜。采用PBS 沖洗3次，每次5 min,滴入生物素化的兔抗鼠二抗,在室溫下放置1 h。再用PBS沖洗3次，每次5 min,滴入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素，采用DAB顯色，脫水，封片。200倍顯微鏡下采集照片，以棕褐色顆粒為陽性信號，結(jié)果采用Image J軟件分析，計算光密度值(IOD)，以IOD/Area比值為相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組唾液腺上皮細胞中ICAM-1mRNA、pIgR mRNA表達情況比較 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA 表達水平明顯高于對照組(P<0.05), pIgR mRNA 表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA和pIgR mRNA 表達量比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

2.22組唾液腺上皮細胞中ICAM-1、pIgR蛋白表達情況比較 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)， pIgR蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，見表2及圖1～4。

表2 2組唾液腺上皮細胞中ICAM-1和pIgR蛋白表達水平比較

注：①與對照組比較，P<0.05。

圖1 對照組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達情況(×200)

3 討 論

唾液腺上皮細胞的異?；罨c干燥綜合征炎癥過程的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)[5-6]，故積極探討唾液腺上皮細胞中相關(guān)因子的表達情況對明確干燥綜合征的發(fā)病機制有重要意義。淋巴細胞灶發(fā)生浸潤是誘發(fā)局部免疫反應(yīng)的一個重要表現(xiàn)[7-8]，而ICAM-1在炎癥介導(dǎo)與機體免疫應(yīng)答、淋巴細胞歸巢等方面扮演著十分重要的角色[9]。本研究結(jié)果顯示， 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 mRNA 表達水平和ICAM-1 蛋白表達水平均明顯高于對照組,提示干燥綜合征患者存在ICAM-1高表達， ICAM-1可能使非淋巴細胞發(fā)生放大炎癥反應(yīng)，進而誘發(fā)干燥綜合征炎癥的發(fā)生。

圖2 研究組唾液腺上皮細胞中ICAM-1 蛋白表達情況(×200)

圖3 對照組唾液腺上皮細胞中pIgR蛋白表達情況(×200)

圖4 研究組唾液腺上皮細胞中pIgR蛋白表達情況(×200)

pIgR基因全長19 kb,含有11 個外顯子,位于染色體1q31- q41,啟動子區(qū)有ISRE、AP-1、NF-κB 和類固醇激素等結(jié)合位點[10-11]。該基因編碼693 個氨基酸, 蛋白分子量90～100 kD, 成熟片段100～120 kD。蛋白結(jié)構(gòu)中有5 個Ig 樣亞單位, 分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)[12]。pIgR介導(dǎo)多聚免疫球蛋白在上皮細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，參與人唾液分泌型IgA (S-IgA)的形成。唾液中的游離SC即pIgR自身的裂解片斷和S-IgA是口腔防御系統(tǒng)的組成成分，與齲病、牙周病、黏膜病等疾病密切相關(guān)。SC/pIgR是適應(yīng)性免疫和先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，一方面，它負責(zé)S-IgA的分泌，是S-IgA的組成成分之一，甚至轉(zhuǎn)運已經(jīng)侵入固有層的病毒或外來抗原，使機體有效地發(fā)揮黏膜適應(yīng)性免疫防御作用；另一方面，游離SC也可能是非特異性免疫分子，參與機體先天性免疫防御[13]。但是多年來研究一直傾向于SC的主要作用是保護S-IgA不被水解酶降解，而忽略了游離SC/pIgR自身的免疫防御功能[14-15]。本研究結(jié)果顯示，研究組唾液腺上皮細胞中pIgR mRNA 表達水平和pIgR蛋白表達水平均明顯低于對照組,提示干燥綜合征患者唾液腺可能由于pIgR的低表達而處于免疫活化狀態(tài)。

綜上所述，ICAM-1、pIgR 異常表達與干燥綜合征密切相關(guān)，ICAM-1 高表達及pIgR 的低表達可能是誘發(fā)干燥綜合征的一個重要發(fā)病機制。