邢雪松 呂威力

(沈陽醫(yī)學院, 1 解剖學教研室, 2 病理學教研室, 沈陽 110034)

缺血性腦損傷是嚴重危害人類健康的疾病,存在高致殘率[1-3]。較多研究已經(jīng)證實腦缺血能促進成年動物腦內(nèi)神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs) 的增殖、遷移和分化,分化的新生神經(jīng)元能部分替代受損的神經(jīng)元,從而在一定程度上改善神經(jīng)功能缺損[4-5]。DACH信號通路參與調(diào)控細胞內(nèi)多種信號途徑,在促進細胞增殖分化等過程中起著十分關(guān)鍵的作用[6]。本研究利用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立大鼠血管性癡呆(vascular dementia, VD)模型,研究檢測Nestin和細胞命運決定因子(cellfate determination factor dachshund 1, DACH1)在血管性癡呆海馬組織中的表達及氣味訓練和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干預作用,探討血管性癡呆內(nèi)源性神經(jīng)干細胞與之相關(guān)因子的改變及氣味訓練的干預,對其增殖分化機制進行初步的闡明。

1 材料和方法

1.1 血管性癡呆模型的制備

健康雄性Wistar大鼠78只,2月齡,體質(zhì)量220～240g,由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為4組： 假手術(shù)組(Sham組,n=6),模型組(Model組,3、7、14、21d,n=24),訓練組(Training組,3、7、14、21d,n=24),bFGF組(bFGF組,3、7、14、21d,n=24)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立血管性癡呆動物模型。術(shù)前12h禁食、4h禁水。1%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉后,仰臥位固定在手術(shù)臺上,常規(guī)消毒,行頸正中切口,分離雙側(cè)頸總動脈(common carotid arteries, CCA),玻璃針小心分離雙側(cè)迷走神經(jīng),避免牽拉,模型組在夾閉雙側(cè)CCA之前,腹腔注射硝普鈉(2.5mg/kg),隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)CCA 10min 后,再通10min,再夾閉10min,再通后縫合傷口,放回籠中保溫飼養(yǎng),慶大霉素局部預防感染。實驗過程中用多導生物記錄儀記錄大鼠血壓,記錄顯示硝普鈉腹腔注射前大鼠平均動脈壓維持在103mmHg左右,注射后平均動脈血壓迅速下降至至51mmHg左右,持續(xù)約2min后緩慢上升至69mmHg,1h內(nèi)持續(xù)維持于該水平。在造模過程中保持動物直腸溫度在37℃ 左右,以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。假手術(shù)組不阻斷CCA及注射硝普鈉,其他與模型組相同。訓練組于造模1d后開始給予氣味訓練,bFGF組腹腔注射bFGF,此后分別于3、7、14、21d后處死取材,常規(guī)H-E染色。

1.2 氣味穿梭訓練

實驗以氣味乙酸異戊酯為條件刺激,電擊為非條件刺激。先將大鼠放入穿梭箱內(nèi)暗適應5min,然后持續(xù)乙酸異戊酯刺激,如大鼠不逃到另一端,則給于電擊,電流強度10～20mA,使動物逃至箱底不通電一側(cè),此時電擊停止,否則持續(xù)受電擊5s。消除氣味后開始下一輪訓練。于造模1d后行氣味穿梭訓練,每次實驗進行20次氣味、電刺激。

1.3 給藥方法

bFGF為北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司研制,用注射用水稀釋, bFGF組腹腔注射10μg/kg,其余組腹腔注射等量生理鹽水,缺血后即刻給藥。

1.4 行為學評分

各組大鼠麻醉清醒后進行模型篩選,造模成功大鼠分別進行神經(jīng)行為學評分,評分參照Zea Longa 5分制標準： 0分： 沒有神經(jīng)功能缺損；1分： 前爪不能完全伸展；2分： 行走時,大鼠向兩側(cè)晃動；3分： 行走時,大鼠身體向兩側(cè)傾倒；4分： 不能自發(fā)行走,有意識喪失。評分為0分和4分者均被剔除,隨機補充,保證每亞組6只不變。

1.5 腦梗死體積測定

各組大鼠于再灌注后3d迅速斷頭取腦,置-70℃冰箱速凍10min,取其前腦從額極到枕極切成2mm厚的冠狀面腦片,將切片立即置于2%TTC磷酸緩沖液中避光、37℃恒溫孵育30min,取出置于4%多聚甲醛中固定2h。正常腦組織被染成鮮紅色,而梗死區(qū)呈蒼白色。將固定的腦片按切片順序排列。數(shù)碼相機拍照后,應用Metamorph-Evolution MP 5.0顯微圖像分析系統(tǒng)測量前腦總面積和腦梗死面積,根據(jù)公式V=t(A1+A2+A3+—+An)-t(A1+An)算出前腦總體積和梗死體積。其中t為切片厚度,A為梗死面積。

1.6 Nestin免疫熒光染色

各組大鼠常規(guī)灌注取腦,連續(xù)冰凍冠狀切片,片厚約30μm,隔5取1,進行免疫熒光檢測。切片首先0.01mol/L PBST,2N HCL/PBS,37℃孵育30min。0.1mol/L硼酸緩沖液浸泡,0.01mol/L PBST。加入血清A,37℃孵育15min,傾去,勿洗。滴加稀釋的羊抗nestin一抗(濃度為1∶2000),4℃過夜。0.01mol/L PBST洗滌。滴加TRITC-兔抗山羊二抗(1∶100),避光條件下,37℃孵育30min。避光條件下,0.01mol/L PBST洗滌。避光條件下,貼片避光、陰干、稀釋甘油封片后熒光顯微鏡觀察并拍片。每只大鼠切片中選取呈典型反應的3張切片,每張切片于海馬齒狀回區(qū)選取3個視野進行計數(shù),采用Image-Pro Plus 5.0圖像處理軟件對結(jié)果進行圖像分析處理,計數(shù)每個視野中nestin陽性細胞數(shù)目。

1.7 DACH1 的免疫組織化學檢測

取各組缺血海馬(AP前囟-3.14～前囟-4.5mm),片厚約3mm,浸入4%多聚甲醛固定液中,24h后應用免疫組織化學染色檢測缺血海馬DACH1的表達情況。切片滴加正常山羊血清(37℃,30min),分別滴加一抗兔抗鼠DACH1 4℃過夜,滴加二抗(37℃,60min),滴加ABC復合液(37℃,60min),以上各步間均PBS沖洗(5min×3次),DAB顯色(15min),蒸餾水沖洗,常規(guī)脫水、透明,中性樹膠封片。空白對照片一抗用0.01mol/L PBS代替。光鏡下觀察切片, 用Metamorph/Evolution MP 5.0顯微圖像分析系統(tǒng)每張切片測5個相同單位面積的平均灰度值。用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0進行t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積比較

假手術(shù)組未見梗死灶,和模型組相比,訓練組和bFGF組梗死體積明顯減小(表1)。

2.2 H-E染色評估組織學改變

假手術(shù)組神經(jīng)元數(shù)量多,排列整齊,形態(tài)完整；模型組細胞腫脹,分布不均,細胞周圍間隙增寬,有的細胞體積縮小,核固縮深染,其中3d組織變化最為明顯；訓練組和bFGF組海馬存活神經(jīng)元數(shù)比模型組增多,神經(jīng)元胞體腫脹明顯減輕,細胞形態(tài)明顯改善。

表1 各組大鼠腦梗死體積比較(mm3)

*P<0.05vsmodel group

2.3 Nestin免疫熒光染色檢測

陰性對照海馬未見nestin陽性細胞。假手術(shù)組海馬僅見少量散在的nestin陽性細胞,3、7、14、21d間相互比較差異無統(tǒng)計學意義。模型組3d時,缺血海馬nestin陽性細胞開始增多,大小不一,呈簇狀分布;7d達峰值;21d海馬nestin免疫陽性細胞數(shù)逐漸減少; 訓練組和bFGF組與模型組比較,3、7、14d和21d缺血海馬nestin陽性細胞均明顯增多(P<0.05) (表2，圖1)。假手術(shù)組大鼠海馬齒狀回顆粒層可以觀察到少量nestin陽性細胞。

表2 大鼠腦缺血后海馬組織nestin陽性細胞數(shù)

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

2.4 氣味訓練對DACH1影響的免疫組織化學檢測

腦組織切片中顯示細胞質(zhì)、細胞核內(nèi)有明顯黃色、棕褐色顆粒為DACH1蛋白陽性。在假手術(shù)組海馬DACH1有輕微表達。DACH1反應產(chǎn)物腦缺血再灌注第7天較假手術(shù)組有所增多,隨缺血再灌注時間的進一步延長逐漸增加,第14天后持續(xù)高水平表達,直到21d(P<0.05)。訓練組和bFGF組,在海馬神經(jīng)元質(zhì)、細胞核內(nèi)可見棕黃色顆粒,DACH1陽性產(chǎn)物表達較3、7、14d和21d 模型組表達增加(P<0.05) (表3,圖1)。

表3 大鼠腦缺血后海馬神經(jīng)元DACH1表達的平均灰度值

△P<0.05vssham group;*P<0.05vsmodel group

3 討論

血管性癡呆是由一系列腦血管因素導致腦組織損害所引起的癡呆綜合癥,以記憶力減退、表情淡漠、呆滯和人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。已證實在成年海馬齒狀回顆粒下區(qū)存在內(nèi)源性神經(jīng)干細胞。在一定條件下NSCs能夠增殖,并向特定方向分化,參與神經(jīng)功能修復的過程[7-8]。

VD患者大腦的病理性變化,如神經(jīng)元丟失,先可以在嗅皮層中觀察到,并逐漸延伸至海馬和其周圍結(jié)構(gòu),已知海馬和內(nèi)嗅皮質(zhì)是VD患者大腦結(jié)構(gòu)中最明顯的易受損區(qū)。海馬是機體感覺和運動的整合區(qū),與認知功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸的可塑性有關(guān),是學習記憶的神經(jīng)細胞學基礎。同時海馬也是嗅覺系統(tǒng)的投射區(qū),可見嗅覺投射區(qū)域與學習記憶神經(jīng)中樞存在部分重疊,故VD和嗅覺之間有在密切聯(lián)系[9-10]。

DACH1蛋白的DS結(jié)構(gòu)域,是DACH1發(fā)揮生物學功能的主要部位。DS結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合能力,可以通過與c-Jun、Smads、Six和ER等轉(zhuǎn)錄因子相互作用,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要功能[11-12]。TGF-β超家族主要由一些在細胞生長、分化、凋亡、遷移或血管生成等方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的多功能細胞因子組成。Dach1與CBP(cyclic AMP-responsive element-binding protein)的結(jié)合可能會競爭性抑制其他需要結(jié)合CBP發(fā)揮作用的分子的功能,例如β-catenin、R-smad(smad2/smad3)等,有研究證明β-catenin可以在CBP的介導下與smad3相結(jié)合,作用于TGF-β的效應基因的作用,抑制TGF-β對Wnt信號通路活性的增強作用[13-15]。因此推測Dach1可以抑制TGF-β和Wnt兩條信號通路對NSCs的促增殖的調(diào)控作用。

本研究通過腦梗死體積比較顯示, 假手術(shù)組未見梗死灶，和模型組相比,訓練組和bFGF組梗死體積明顯減小。說明訓練組和bFGF組對血管性癡呆大鼠腦損傷具有修復作用。本研究通過Nestin免疫熒光染色檢測顯示,模型組和bFGF組大鼠腦缺血后7d時神經(jīng)干細胞增殖達高峰,21d時干細胞數(shù)量下降,分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。本實驗觀察氣味訓練和bFGF組對缺血再灌注后大鼠海馬DACH1表達的影響,結(jié)果顯示訓練組和bFGF組DACH1陽性產(chǎn)物表達較模型組海馬明顯增加,21d達高峰,從一個側(cè)面探討氣味訓練和bFGF對神經(jīng)干細胞增殖分化的作用機制。

圖1 血管性癡呆大鼠海馬nestin、DACH1陽性細胞及H-E染色,×200Fig 1 Nestin and DACH1 positive cells of vascular dementia rats, ×200A: Nestin positive cells of model 7d group; B: Nestin positive cells of training 7d group; C: Nestin positive cells of model 21d group; D: Nestin positive cells of training 21d group. E: DACH1 positive cells of model 7d group; F: DACH1 positive cells of training 7d group; G: DACH1 positive cells of model 21d group; H: DACH1 positive cells of training 21d group; I: H-E staining of model 3d group; J: H-E staining of training 3d group