王江栓 李變鋒 李 磊 張義丹 曹 靖 程 琦△

(漯河醫(yī)學高等?？茖W校, 1 解剖學教研室, 2 第二附屬醫(yī)院, 漯河 462000； 3 鄭州大學基礎醫(yī)學院解剖學教研室, 鄭州 450001)

奧沙利鉑是第3代鉑類抗癌藥物,是繼順鉑、卡鉑之后抗癌譜更廣、療效更好、副作用更低,且與順鉑和卡鉑之間無明顯交叉耐藥的鉑類抗腫瘤藥[1]。但是,隨著奧沙利鉑在臨床日益廣泛的應用,其毒副作用,特別是神經(jīng)毒性的出現(xiàn),限制了其臨床應用[2]。奧沙利鉑神經(jīng)毒性臨床表現(xiàn)主要為冷刺激誘發(fā)或加劇的肢體末端感覺異常,其發(fā)生機制目前仍不明確。研究表明,奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)毒性癥狀可能是由于奧沙利鉑對細胞膜上陽離子通道的影響所致,本研究探索鉀通道是否參與奧沙利鉑所致疼痛的發(fā)生發(fā)展,以及利用實驗動物嘗試促進鉀通道表達的藥物緩解奧沙利鉑化療痛。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和模型建立

SPF清潔級、成年雄性SD大鼠(購于河南省實驗動物中心),體質量180～220g,大鼠被安放在清潔開放的房間,在12h光照/黑暗的環(huán)境中飼養(yǎng),室溫維持在22～25℃,自由進食水,采用雙盲法進行相關行為學檢測。采用隨機方法把36只SD大鼠分成對照組和奧沙利鉑組。奧沙利鉑注射液購于齊魯制藥(海南)有限公司(產(chǎn)品批號： 2A1E1510017B)；5%葡萄糖注射液購于浙江濟民制藥有限公司(產(chǎn)品批號： 12050611)；奧沙利鉑注射液溶解于5%葡萄糖注射液中,以4.8mg/kg進行腹腔注射,模擬臨床給藥時間點給藥,注射時間分別為第1、2、8、9、15、16、22天共7次。奧沙利鉑誘導周圍神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型建立成功第15天給予氟吡汀灌胃(5、50mg/kg)。

1.2 行為學檢測

機械疼痛測試采用經(jīng)典的von-Frey纖毛,將纖毛通過金屬網(wǎng)眼垂直刺大鼠后足底中心皮膚,用力至彎曲成S形,每次刺激持續(xù)3～4s,觀察反應,大鼠在刺扎時間內(nèi)或在移開von、Frey針時出現(xiàn)快速的縮足或舔足反應,記為陽性。

足對有害熱退縮潛伏期測定用模型336鎮(zhèn)痛儀(美國),大鼠置于有機玻璃室的玻璃板上,輻射熱穿過玻璃板照射足底表面的中間。當動物抬腳時,光束斷開,每一側每次試驗重復5次,間隔為5min,無論有無陽性為避免組織損傷光束截止時間15s。

足對有害低溫退縮潛伏期(0℃)的測定用1個冷板,其被設置在0℃,足放置在平板開始計時,至舔足和退縮終止,定義為冷刺激縮回潛伏期。每個實驗重復3次,每次時間間隔為10min。60s為截止時間,避免足底組織損傷。

1.3 獲取標本

大鼠建模后在第3天、8天、15天采用10%的水合氯醛3.5ml/kg腹腔注射麻醉,取第4～5腰椎(L4～L5)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)用于RT-PCR、免疫印跡、免疫組織化學方法檢測。

1.4 RT-PCR

總RNA通過TRIzol法,oligo dT為通用引物,使用Thermo Script逆轉錄酶,兩步法RT。每個樣品3個復孔,根據(jù)目的基因設計特異性正向和反向引物。反應在BIO-RAD CFX96實時PCR儀器中進行。65℃～95℃溶解曲線,反應完成后,Bio-Rad Prime PCR軟件分析熒光信號數(shù)據(jù),計算各反應管Ct值。所得數(shù)據(jù)以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt方法計算各目的基因的相對表達。

1.5 免疫印跡檢測

冰上研磨組織,加入胞質裂解緩沖液,低溫離心,上清為胞質蛋白,蛋白質濃度檢測；SDS-PAGE電泳(10% SDS分離膠)；免疫反應(兔抗Kv1.2單克隆抗體,購于以色列Alomone Labs公司,按1∶1000稀釋；兔抗β-actin單克隆抗體,購于北京中杉生物科技公司,辣根過氧化物酶結合的山羊抗兔二抗購于美國Jackson公司),曝光(美國Protein Simple FC-M型化學發(fā)光成像系統(tǒng))。

1.6 雙標熒光免疫組織化學顯色

大鼠麻醉后,4%多聚甲醛灌注。獲取DRG后固定并逐步脫水,冷凍切片。0.01mol/L的PBS含有10%血清和0.3%的Triton X-100室溫下封閉1h,一抗(兔抗Kv1.2單克隆抗體)4℃過夜,0.01mol/L的PBS洗3遍,二抗(鼠抗CY3單克隆抗體購于美國Jackson公司)室溫下1h。使用Leica DMI4000熒光顯微鏡拍照。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 行為學的變化

奧沙利鉑組與對照組在給藥前行為學無差異。注射奧沙利鉑以后大鼠的機械痛閾值和冷覺痛閾值均開始減低,第8天開始2組大鼠機械痛閾值和冷覺痛閾值均差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.001),一直持續(xù)到第22天。而大鼠的熱覺痛閾值和體重兩者之間無明顯差異,提示奧沙利鉑的消化道不良反應比較輕微(圖1)。

圖1 腹腔注射奧沙利鉑后,奧沙利(OXA)鉑組大鼠的機械閾值(A)

給予氟吡汀灌胃后可以緩解奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛,給予5mg/kg氟吡汀后機械痛閾值較奧沙利鉑組明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而冷覺痛閾值無明顯的變化。給予50mg/kg氟吡汀后機械痛閾值和冷覺痛閾值較奧沙利鉑組明顯增高,差異均具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 奧沙利鉑(OXA)組大鼠灌胃給予5、50mg/kg氟吡汀后,兩種劑量

2.2 DRG中Kv1.2的變化

大鼠DRG中Kv1.2的mRNA和蛋白表達在給予奧沙利鉑后的第3天無明顯的變化,但在第8天和第15天均減低,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(圖3,P<0.01)。

2.3 大鼠DRG中Kv1.2的分布

在DRG神經(jīng)元中,Kv1.2與CGRP(傷害性肽能神經(jīng)元標記物)、NF-200(有髓鞘的非傷害性感覺神經(jīng)元標記物)、IB4(無髓鞘的傷害性感覺神經(jīng)元標記物)共標,而與GS(膠質細胞標記物)不共標(圖4，見封二)。

3 討論

奧沙利鉑是繼順鉑、卡鉑之后抗癌譜更廣、療效更好、副作用更低的鉑類抗癌藥[1-2]。眾多的臨床研究資料顯示,奧沙利鉑在在卵巢癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等實體瘤的治療中都取得較好的治療效果[3-4],但是其神經(jīng)毒副作用嚴重限制了其臨床應用,因此探明奧沙利鉑的神經(jīng)毒副作用的機制,找到可行的解決方案,將有可能幫助解決其臨床應用的障礙。

奧沙利鉑誘導的神經(jīng)毒性有兩種類型,一種是快速的急性感覺神經(jīng)病變,另一種通常發(fā)生幾個周期之后,為延遲的累積性的感覺神經(jīng)病變[5]。其中急性周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率為86%～95%,以周圍神經(jīng)過度興奮為特征,臨床表現(xiàn)為冷刺激誘發(fā)或加劇的肢體末端感覺異常和感覺遲鈍,包括下巴痛、眼痛、注射藥物一側肢體痛、上瞼下垂、下肢痙攣以及視力和聲音改變等癥狀。這些癥狀在用藥后數(shù)小時即可出現(xiàn),24～48h為高峰期,一般持續(xù)7d左右[6]。奧沙利鉑所致慢性周圍神經(jīng)病變臨床表現(xiàn)為末梢感覺減退或感覺缺失、上下肢麻木等,嚴重時造成肢體功能障礙[7]。其發(fā)生率與劑量相關,具有蓄積性和可逆性。蓄積性一方面表現(xiàn)為慢性神經(jīng)病變發(fā)生率隨劑量累積而增加,另一方面表現(xiàn)為相關癥狀的持續(xù)時間和嚴重程度隨劑量累積延長和加重。

圖3 在奧沙利鉑組大鼠的DRG中8d、15d的Kv1.2

奧沙利鉑所致慢性周圍神經(jīng)病變的發(fā)生機制目前仍不明確,目前國內(nèi)外的研究表明,奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)毒性癥狀是由于奧沙利鉑對細胞膜上陽離子通道的影響所致。神經(jīng)元細胞膜上陽離子通道包括鉀通道、鈣通道、鈉通道等[8-9]。其中鉀通道的活性與細胞膜的靜息電位密切相關,是神經(jīng)元興奮性的重要決定因素[10]。抑制鉀通道可導致神經(jīng)元細胞的異位放電頻率增加,從而參與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[11]。Li等[12]研究證明損傷DRG后伴隨Kv電流減少,說明鉀離子通道在DRG損傷引起的疼痛中起到至關重要的作用。有研究[13]表明坐骨神經(jīng)慢性壓榨性損傷(chronic constrictive injury， CCI)模型側的背根神經(jīng)節(jié)上的Kv通道的α亞基表達較對側顯著降低,提示DRG的Kv電流降低與神經(jīng)興奮性升高顯著相關。有報道[14]稱神經(jīng)元損傷后鉀離子電流的減少,會出現(xiàn)神經(jīng)興奮性增高進而導致痛覺過敏。提示神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生可能與神經(jīng)元細胞上表達的鉀離子通道電流降低有密切關系。那么,鉀離子通道的變化是否與奧沙利鉑化療痛相關？

研究需要合適的動物模型,本研究通過采用模擬臨床藥物應用時間點給予大鼠注射藥物建立奧沙利鉑動物模型。實驗結果顯示給予奧沙利鉑后,大鼠的機械閾值和冷覺閾值均出現(xiàn)明顯的降低,說明模型建立成功,而大鼠的體質量無明顯的變化,說明奧沙利鉑的消化道毒性比較輕微,因此為研究其發(fā)生機制提供了較好的動物模型。本實驗在奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛大鼠模型中檢測到Kv1.2的mRNA和蛋白的表達量均降低,且存在時間依賴性。提示Kv1.2可能參與奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛,為臨床上預防和治療奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛提供新的靶點。實驗繼續(xù)嘗試鉀離子興奮藥物觀察是否緩解奧沙利鉑誘導的化療痛。本實驗應用鉀離子興奮劑氟吡汀灌胃治療,通過灌胃給予大鼠不同劑量的氟吡汀后,模型大鼠機械閾值和冷覺閾值明顯增高,并且50mg/kg的效果較5mg/kg的明顯,說明氟吡汀緩解奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛呈劑量依賴性,但是最佳劑量需要進一步的實驗探索。氟吡汀是一種鉀離子通道的興奮劑,可以降低神經(jīng)元的興奮性,穩(wěn)定膜電位,緩解奧沙利鉑導致鉀離子通道1.2的表達下降導致的鉀通道功能的降低,說明鉀離子通道在奧沙利鉑誘導周圍神經(jīng)性疼痛中起到重要的作用。

總之,Kv1.2在奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)疼痛的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,可能為臨床上預防和治療奧沙利鉑誘導的周圍神經(jīng)性疼痛提供新的靶點和新的方向。