盧 浩 吳雷振 張瑞平 張玉玲 錢志英 張順利

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 省部共建細胞分化調(diào)控國家重點實驗室, 新鄉(xiāng) 453007)

免疫抑制劑的研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點。槲皮素(quercetin)屬黃酮類化合物,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用[1-2]。近期研究顯示槲皮素在對抗細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致流產(chǎn)過程中具有獨特功效。當細菌侵入受孕機體后,其表面LPS可與巨噬細胞CD14相結(jié)合,進而激活巨噬細胞分泌炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α),并伴隨著子宮巨噬細胞大量遷移至內(nèi)膜,形成不利于胚胎發(fā)育的環(huán)境[3]。槲皮素可抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞功能活性,減少其TNF-α和NO(nitric oxide, NO)產(chǎn)生[4],下調(diào)LPS所誘導(dǎo)細胞的單核細胞趨化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)分泌量[5]。本課題組前期研究證明,中藥水紅花子對LPS 誘導(dǎo)流產(chǎn)小鼠子宮巨噬細胞具有抑制效應(yīng)及保胎作用[6],而槲皮素是水紅花子的主要成分之一。為此,本研究旨在探討槲皮素對小鼠的抗流產(chǎn)效應(yīng)和免疫抑制作用的分子機制,為中藥免疫抑制劑的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑與器材

槲皮素(南京澤朗醫(yī)藥有限公司)；蛋白酶抑制劑(PMSF),LPS(美國Sigma公司)；兔抗鼠CD14抗體,SABC(兔IgG)試劑盒,小鼠MCP-1 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB酶底物顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)等。

1.2 實驗動物分組及模型建立

昆明種6～8周齡未經(jīng)產(chǎn)雌鼠200只與雄鼠30只,體質(zhì)量25g(購自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心),常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水,制作小鼠陰道涂片進行動情期鑒定。而后將動情期雌鼠與雄鼠2∶1合籠過夜,次日清晨陰道口檢出陰栓者定為孕0天(D0)。而后將孕鼠隨機分為對照組和實驗組,對照組為PBS處理組,實驗組分別為LPS流產(chǎn)模型組、槲皮素處理組、槲皮素+LPS處理組。各組分別于末次注射后1、3、6、12、24h時取其子宮,觀察子宮與胚胎狀況,每組每時間點取10只。小鼠左側(cè)子宮角用做免疫組織化學(xué),右側(cè)用做ELISA檢驗。其具體處理方式如表1。

表1 各組小鼠處理方法

1.3 流產(chǎn)率和胚胎吸收率檢測

剖腹取小鼠子宮并觀察其胚胎狀況,記錄流產(chǎn)小鼠數(shù)量和胚胎吸收數(shù),并計算胚胎吸收率[胚胎吸收率=被胚胎吸收數(shù)/(被胚胎吸收數(shù)+未被胚胎吸收數(shù))×100%]和流產(chǎn)率(流產(chǎn)率=流產(chǎn)小鼠數(shù)/妊娠小鼠數(shù)×100%)。

1.4 免疫組織化學(xué)顯色

將石蠟切片(6μm)于烘箱烘烤60min；經(jīng)常規(guī)脫蠟復(fù)水后,置于0.3% H2O220min封閉內(nèi)源性過氧化物酶,經(jīng)抗原修復(fù)后用10%正常山羊血清封閉非特異性染色。而后分別滴加1∶100兔抗鼠CD14抗體,于37℃孵育40min后,依次滴加1∶200稀釋的生物素標記羊抗兔IgG和1∶200辣根過氧化酶標記鏈酶卵白素,均于37℃孵育40min；DAB顯色,鏡檢,照相。

1.5 子宮組織勻漿液制備和ELISA測定TNF-α、MCP-1含量

將小鼠子宮置于預(yù)冷PBS中剪除多余脂肪,剖開子宮,剝離胚胎。在含0.75μg/ml PMSF的PBS中冰浴勻漿,12000r/min、4℃離心15min,取上清液分裝,-80℃凍存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行TNF-α、MCP-1檢測,反應(yīng)后即刻在酶標儀450nm處讀取OD值,由標準曲線分別計算出各組樣品中TNF-α、MCP-1含量(pg/ml)。

1.6 細胞計數(shù)和統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對小鼠胚胎發(fā)育的影響

對照組和槲皮素組無流產(chǎn)現(xiàn)象,胚胎正常,輪廓清晰,呈暗紅色,且無出血、淤血現(xiàn)象。模型組全部發(fā)生流產(chǎn),剖檢發(fā)現(xiàn)其胚胎死亡率為100%,胎盤結(jié)構(gòu)亦嚴重破壞。槲皮素+LPS組也有流產(chǎn)現(xiàn)象,但與模型組相比,流產(chǎn)率與胚胎吸收率顯著降低(P<0.01)(表2)。

2.2 槲皮素對小鼠子宮巨噬細胞的影響

槲皮素+LPS組小鼠子宮組織CD14+巨噬細胞數(shù)量與對照組相比,除24h外,各時間點差異均存在統(tǒng)計學(xué)意義,且自6h開始顯著降低,肌層組織CD14+巨噬細胞數(shù)量在24h時恢復(fù)至對照組水平；與模型組相比,總體數(shù)量明顯減少(P<0.01)(圖1)。

表2 各組小鼠胚胎發(fā)育結(jié)果(%)

Note：**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsmodel

圖1 槲皮素對小鼠子宮內(nèi)膜(A)、肌層(B)和外膜(C)

2.3 槲皮素對小鼠子宮CD14蛋白表達的影響

槲皮素+LPS組小鼠子宮組織CD14蛋白量與對照組相比,除肌層組織自6h后無差異外,其余各組織各時間點均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比,總體含量明顯減少(P<0.01)(圖3)。

2.4 槲皮素對小鼠子宮TNF-α、MCP-1含量的影響

槲皮素+LPS組小鼠子宮組織TNF-α、MCP-1含量與對照組相比,各時間點均顯著升高(P<0.01),但自6h開始明顯降低,卻仍存在差異；與模型組相比,總體含量明顯減少(P<0.01)(圖4)。

3 討論

妊娠是一個各系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)非常復(fù)雜的生理過程,母-胎界面正常免疫耐受的維持是妊娠成功與否的關(guān)鍵[7]。當LPS進入孕鼠體內(nèi)后,通過與CD14、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)等受體結(jié)合[8],激活分布在內(nèi)膜基底層與功能層的巨噬細胞,促進IL-2、TNF-α、MCP-1等多種細胞因子的分泌,募集巨噬細胞到達此部位發(fā)生作用,導(dǎo)致子宮局部免疫微環(huán)境的失衡,不利于胚胎發(fā)育。槲皮素在對抗LPS致流產(chǎn)過程中具有獨特功效,為進一步研究其抗流產(chǎn)效應(yīng)及其免疫抑制作用機制,本實驗采用LPS和槲皮素對孕鼠進行處理,觀察其胚胎發(fā)育情況,研究結(jié)果顯示,對照組和槲皮素組無流產(chǎn)現(xiàn)象,而模型組小鼠流產(chǎn)率與胚胎死亡率均高達100%；槲皮素+LPS組流產(chǎn)率和胚胎吸收率雖高于正常對照組,但卻顯著低于模型組。有研究證實,LPS可誘導(dǎo)小鼠子宮吸收胚胎,而槲皮素可抑制子宮收縮,利于胚胎著床和發(fā)育,降低小鼠子宮對胚胎的吸收[9-10]。此均表明LPS可有效誘發(fā)小鼠流產(chǎn),而槲皮素可以對抗LPS引發(fā)的小鼠流產(chǎn)。

圖2 3h小鼠子宮CD14+巨噬細胞免疫組織化學(xué)顯色,×200

有研究證明LPS可通過LPS-LBP-CD14-TLR4途徑激活巨噬細胞,誘發(fā)流產(chǎn),但是LPS不能穿越胎盤進入胚胎,也不直接影響孕鼠的內(nèi)分泌功能[11],提示LPS所激活的巨噬細胞的變化是導(dǎo)致小鼠流產(chǎn)的關(guān)鍵,CD14可特異性標記子宮巨噬細胞[12],故本實驗系統(tǒng)檢測了CD14+巨噬細胞在小鼠子宮各組織的數(shù)量、遷移分布和功能活性變化,以及CD14蛋白的表達與子宮TNF-α、MCP-1的含量變化,分析其各項指標與胚胎丟失之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組小鼠各時間點各層組織CD14+巨噬細胞數(shù)量和CD14表達量均顯著增多,提示LPS可能通過激活巨噬細胞,上調(diào)CD14表達量,繼而誘發(fā)流產(chǎn)。而槲皮素+LPS組小鼠蛻膜組織CD14+巨噬細胞數(shù)量和CD14表達量相比對照組均顯著增多,相比與模型組,卻均顯著減少。表明槲皮素可有效對抗LPS所誘導(dǎo)的CD14+巨噬細胞向子宮內(nèi)膜遷移和聚集,降低CD14表達量,抑制其功能活性,推測槲皮素可能是通過阻斷LPS-LBP-CD14-TLR4途徑,抑制巨噬細胞的激活,以達到抗流產(chǎn)作用。LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)的一個重要機制是誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α,LPS既能使經(jīng)γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)預(yù)致敏的巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α,又可直接刺激小鼠脾細胞釋放IFN-γ,進而刺激活化巨噬細胞釋放TNF-α[13]。與之相對應(yīng)的是,模型組小鼠子宮各時間點TNF-α的含量均顯著高于其余各組,MCP-1的含量亦顯著高于其余各組。有文獻報道,LPS可致使機體輔助型T淋巴細胞(T helper cell, Th)免疫平衡偏向不利于妊娠的Th1方向,炎癥反應(yīng)增強；槲皮素可使機體免疫平衡朝Th2方向偏移,抑制細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)和 巨噬細胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)的表達,有利于妊娠的發(fā)生,達到保胎效果[14]。本研究經(jīng)過槲皮素處理之后的槲皮素+LPS組小鼠各時間點TNF-α、MCP-1含量雖高于對照組,但卻顯著低于模型組。表明槲皮素能下調(diào)LPS所誘導(dǎo)細胞MCP-1的分泌,繼而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),而巨噬細胞的遷移分布受MCP-1的調(diào)節(jié),TNF-α可刺激炎癥細胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)如MCP-1和ICAM-1, MCP-1可趨化巨噬細胞在內(nèi)膜和外膜之間的遷移[15],與本研究結(jié)果一致。

圖3 槲皮素對小鼠子宮CD14蛋白表達的影響

圖4 槲皮素對小鼠子宮TNF-α (A)、MCP-1 (B)含量的影響

本研究通過研究槲皮素對LPS誘發(fā)流產(chǎn)小鼠子宮中巨噬細胞表型、分布、活性及功能的影響,揭示了趨化孕鼠子宮內(nèi)膜和蛻膜巨噬細胞遷移分布的調(diào)節(jié)因素,從分子水平上闡明了槲皮素的抗流產(chǎn)效應(yīng)和免疫抑制作用機制,為中藥免疫抑制劑的研制和抗感染性因素導(dǎo)致的流產(chǎn)的中藥活性成分篩選提供了新的理論和實驗依據(jù)。