李彩玲 張 瑞 戚林增 張晴晴 黃嫦珍 安 然 田 鏵 丁海玲 張立平△

(山東大學(xué), 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)研究所, 2 第二醫(yī)院信息中心, 濟南 250012； 3 齊魯理工學(xué)院, 濟南 250200)

腫瘤微環(huán)境通過多種途徑抑制免疫細(xì)胞的功能、促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸及侵襲和轉(zhuǎn)移是近幾年研究的熱點[1]。趨化因子及其受體調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的循環(huán)、歸巢及其在腫瘤組織中的駐留等,在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。食管癌是我國常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的前列[3]。食管癌微環(huán)境是否對淋巴細(xì)胞的CC類趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type 7, CCR7)表達(dá)產(chǎn)生影響尚無研究報道。本研究通過觀察食管癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)與未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞CCR7的表達(dá)情況,探究食管癌微環(huán)境對淋巴細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響,有望為尋找食管癌新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例資料

收集山東省腫瘤醫(yī)院病理科2012～2014年行食管癌手術(shù)的標(biāo)本30例,其中男性25例,女性5例；年齡50～71 歲,中位年齡64歲。癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況： 其中轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)40個,未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)34個。全部患者均行手術(shù)并經(jīng)病理證實,術(shù)前均無放療、化療及免疫治療史。所有標(biāo)本的獲取均征得患者及其家屬的同意。

1.2 免疫組織化學(xué)顯色

取石蠟包埋的組織塊,5μm厚連續(xù)切片,于60℃烤片1h；常規(guī)脫蠟、水化、H2O2去除組織內(nèi)過氧化物酶,組織抗原修復(fù)15min，BSA封閉20min,鼠抗人CCR7一抗(購自英國Abcam公司)4℃過夜,加入多聚輔助試劑孵育20min,辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠二抗(購自英國Abcam公司)孵育20min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、固片,待切片晾干后,置于顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)顯色判斷標(biāo)準(zhǔn)： 以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá),以染色強度和陽性細(xì)胞百分比的評分作為標(biāo)準(zhǔn)。染色強度評分： 無色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分比評分： 在低倍鏡下隨機選擇10個視野,高倍鏡下計數(shù)。每個視野記錄100個細(xì)胞,并計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù),結(jié)果取10個視野的平均百分?jǐn)?shù)。其中無陽性細(xì)胞為0分,陽性細(xì)胞<25%為1分,陽性細(xì)胞25%～50%為2分,陽性細(xì)胞>50%為3分。以染色強度與陽性細(xì)胞百分比評分的乘積表示表達(dá)強度： 0分為(-),1～3分為(+),4～6分為(++),7～9分為(+++)；其中,<4分為陰性表達(dá),≥4分為陽性表達(dá)[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

匯總免疫組織化學(xué)結(jié)果,應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析,計數(shù)資料用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CCR7在食管癌細(xì)胞的表達(dá)

30例原位食管癌組織標(biāo)本中,22例患者標(biāo)本為CCR7陽性表達(dá),其陽性表達(dá)率為73.3%。在食管癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中,食管癌細(xì)胞的CCR7表達(dá)明顯降低。

2.2 食管癌轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的CCR7表達(dá)

食管癌未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞高表達(dá)CCR7(圖1A、B),而食管癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞不表達(dá)或弱表達(dá)CCR7(圖1D、E)。

將免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果進(jìn)行評分,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,食管癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞CCR7表達(dá)強度明顯低于未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),CCR7表達(dá)陽性率分別為40.00%和88.24%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,表2)。

3 討論

趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用備受關(guān)注。以往研究表明,表達(dá)趨化因子受體的腫瘤細(xì)胞可沿著趨化因子梯度向遠(yuǎn)隔器官轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)染CCR7、CXCR4、CCR10分別促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞向區(qū)域淋巴結(jié)、肺和皮膚轉(zhuǎn)移[5-7]。CCR7主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DCs)等免疫細(xì)胞,其配體CCL19/CCL21特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,淋巴結(jié)高內(nèi)皮靜脈,非淋巴組織的淋巴管內(nèi)皮,脾T細(xì)胞富集區(qū)等。CCR7在T細(xì)胞表面的表達(dá)能夠抑制免疫細(xì)胞的凋亡,增強T細(xì)胞的活力并促進(jìn)T細(xì)胞在淋巴組織中的遷移,對淋巴細(xì)胞的活性及免疫功能十分重要[8-9]。CCR7通過介導(dǎo)T細(xì)胞和DC向淋巴結(jié)遷移引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答和抗腫瘤反應(yīng)[10-11]。

表2 轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞CCR7表達(dá)率

*P<0.01vsno metastasis

近年來研究證明,食管癌細(xì)胞的CCR7表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后有關(guān)[12-14]。很多其他腫瘤,如胃癌,乳腺癌,肺癌,甲狀腺乳頭狀癌等,也表達(dá)CCR7,并促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[4,15-19]。然而,食管癌患者淋巴細(xì)胞的CCR7表達(dá)情況尚未見報道。

本研究通過采集食管癌患者的淋巴結(jié)組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色,觀察了CCR7在淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。證實原位食管癌在高表達(dá)CCR7的同時,其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞CCR7表達(dá)卻減弱或消失,提示腫瘤微環(huán)境通過某種因素影響淋巴細(xì)胞的CCR7表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-10等多種免疫抑制因子,直接抑制DCs和效應(yīng)T細(xì)胞；腫瘤微環(huán)境中有多種免疫抑制性細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,調(diào)節(jié)性DCs,腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞,髓系抑制性細(xì)胞等；腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性網(wǎng)絡(luò)抑制免疫應(yīng)答,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[20]。食管癌微環(huán)境是否通過某種免疫抑制細(xì)胞或因子降低淋巴細(xì)胞的CCR7表達(dá),從而介導(dǎo)免疫逃逸,有待進(jìn)一步研究。另外,本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的食管癌細(xì)胞CCR7表達(dá)明顯降低,其機制有待進(jìn)一步探索。