黃 璐 張景航 李超紅 賈祥磊 趙寶生 劉玉珍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院, 河南省神經(jīng)修復重點實驗室, 衛(wèi)輝 453100)

近年來由于環(huán)境污染加重,空氣中有害因子增加,呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年升高,其預防和治療成為目前關注的重點[1]。代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptor, mGluR)不僅廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與谷氨酸能神經(jīng)突觸傳遞,而且也表達于多種外周組織,參與調(diào)節(jié)其生物學功能[2-4]。研究表明,外周血谷氨酸水平增高和創(chuàng)傷性腦損傷引起的急性肺損傷相關[5]。mGluR分為3組,小鼠肺組織表達Ⅱ組mGluR,內(nèi)毒素通過促進肺組織谷氨酸釋放,激活Ⅱ組mGluR,從而導致急性肺損傷[6]。然而,Ⅰ組mGluR在肺組織中的表達和定位尚未清楚,本研究觀察了Ⅰ組mGluR在大鼠、小鼠和人肺組織中的表達和定位,為探討其在肺組織的功能及闡明肺部疾病的發(fā)病機制和防治措施提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

成年SD大鼠12只,230～270g；成年Balb/c小鼠12只,19～21g,雌、雄各6只。動物來源為山西醫(yī)科大學實驗動物中心,清潔級,動物合格證號： SCXK(晉)20150001。4例人肺組織均來源于支氣管擴張患者的正常肺組織,患者年齡為45～56歲,男性3例,女性1例,經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科檢驗,該部分肺組織為正常肺組織。

大鼠用10%水合氯醛麻醉后斷頭,取右肺組織,用預冷生理鹽水沖洗干凈后,80℃保存,用于提取RNA和蛋白。另外,大鼠進行麻醉后,剪開兩側肋骨,暴露心,從左心室經(jīng)主動脈灌注生理鹽水,待流出液變澄清后換4%中性甲醛灌注,直至動物全身僵硬。取右肺組織,置4%中性甲醛溶液固定24h,用于包埋蠟塊,制作石蠟切片。小鼠肺組織采集同大鼠。人肺組織從手術臺取下之后,立即用預冷生理鹽水進行沖洗,剪取一部分置于-80℃用于提取RNA和蛋白,其余置于4%中性甲醛在4℃下固定1周,用于制備石蠟切片。

1.2 RT-PCR檢測mRNA表達

應用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取肺組織總RNA。RNA經(jīng)DEPC水重懸后測定RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RNA用量為500ng,逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl。取2μl cDNA進行PCR,根據(jù)PCR試劑盒(TaKaRa公司)說明書進行操作。引物由華大基因公司合成,引物信息及PCR條件如表1所示,β-actin和GAPDH為內(nèi)參對照。將PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,使用UVI pro(Uvitec公司)凝膠成像分析系統(tǒng)進行曝光成像。

表1 RT-PCR引物

1.3 免疫印跡分析檢測蛋白表達

使用RIPA裂解液提取肺組織蛋白后測定蛋白濃度,根據(jù)試劑說明書(武漢博士德生物有限公司)進行操作。取30μg蛋白樣品進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶封閉1h后,4℃孵育一抗過夜,一抗用5% BSA-TBST稀釋,稀釋比例為： 兔抗mGluR5,1∶2000(Abcam公司);兔抗β-actin,1∶1000(CST公司)。次日,孵育二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG,1∶8000(北京鼎國昌盛生物有限責任公司),室溫置搖床上輕搖1h。ECL顯色液顯色(武漢博士德生物有限公司),用Amersham Imager 600化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE)系統(tǒng)進行曝光成像。

1.4 免疫組織化學方法檢測定位

對大鼠、小鼠和人肺組織進行石蠟包埋并切片,切片厚度為3μm。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化處理后,使用枸櫞酸鈉熱修復法進行抗原修復。3% H2O2室溫孵育30min去除內(nèi)源性過氧化氫酶,山羊血清封閉1h。4℃ 孵育兔抗mGluR5一抗過夜(1∶200,Abcam公司),陰性對照組用PBS代替一抗。次日,根據(jù)GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒說明書(上?；蚩萍加邢薰?滴加HRP標記聚合物后,室溫下孵育30min,光學顯微鏡下進行DAB顯色。蘇木精復染后進行中性樹膠封片,使用尼康顯微鏡(ECLIPSE 55i型)觀察,攝像系統(tǒng)為Nikon DS-Filc。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Ⅰ組mGluR mRNA在肺組織中的表達

為檢測mGluR1和mGluR5 mRNA在肺組織中的表達情況,使用RT-PCR方法對目的基因進行擴增,擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,以各自物種的腦組織作為陽性對照。電泳結果顯示,內(nèi)參及陽性對照均可見正常PCR擴增條帶,mGluR1在大鼠和小鼠肺組織中沒有檢測到PCR擴增條帶,而在人肺組織中可見mGluR1 mRNA表達(圖1)。mGluR5 mRNA在大鼠、小鼠和人肺組織中均可見陽性表達,并且其在人肺組織中的表達量多于mGluR1(mGluR1vsmGluR5,1.000±0.049vs1.630±0.079,P<0.01)(圖1)。

根據(jù)上述結果,選擇在大鼠、小鼠和人肺組織中均有表達的mGluR5進行免疫印跡分析,并以各自物種的腦組織作為陽性對照。免疫印跡檢測結果顯示(圖2),腦組織在132kD及>250kD處可見條帶,大鼠、小鼠和人肺組織在132kD處均可見條帶,說明mGluR5蛋白在三者肺組織均有表達。

2.2 肺組織mGluR5免疫組織化學表達

免疫組織化學表達顯示,大鼠肺組織中,mGluR5在小支氣管上皮及終末細支氣管上皮呈棕色染色(圖3A、a、B、b，見封三)。此外,mGluR5在肺泡,包括肺泡上皮和毛細血管具有明顯著色(圖3C、c，見封三)。

圖1 肺組織mGluR1和mGluR5 mRNA表達

圖2 肺組織mGluR5蛋白的表達

而肺內(nèi)血管,包括平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞也表達mGluR5(圖3D、d，見封三)。小鼠肺組織mGluR5免疫組織化學染色結果與大鼠一致(圖3E～H、e～h，見封三)。在人肺組織,mGluR5在小支氣管和終末細支氣管未見染色(圖3I、i、J、j，見封三),在肺泡和血管可見明顯著色(圖3K、k、L、l，見封三)。

3 討論

谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),通過與谷氨酸受體結合發(fā)揮作用。谷氨酸受體分為離子型和代謝型受體,代謝型谷氨酸受體分為3個組8個亞型,Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5,Ⅱ組包括mGluR2和mGluR3,Ⅲ組包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8[7]。

本研究結果顯示,mGluR1 mRNA在人肺組織中表達,而在大鼠和小鼠肺組織未獲得mGluR1 PCR擴增條帶,可能原因為： (1) 大鼠和小鼠肺組織不表達mGluR1,所以檢測不出；(2) mGluR1在大鼠和小鼠肺組織中呈低水平表達,所用實驗方法不足以檢測到。本研究結果說明mGluR5在肺組織中具備發(fā)揮功能性作用的蛋白質(zhì)物質(zhì)基礎,可作為信號分子調(diào)節(jié)生物學功能。

在肺組織中,因葉支氣管至小支氣管管壁結構與支氣管基本相似,而終末細支氣管和呼吸性細支氣管管壁結構相似,因此本研究選擇小支氣管和終末細支氣管進行觀察[8]。免疫組織化學顯色顯示,mGluR5在人和鼠肺組織中的分布存在異同性。相同性表現(xiàn)為： (1) mGluR5共同表達于大鼠、小鼠和人肺泡,包括肺泡上皮和毛細血管；(2) mGluR5共同表達于大鼠、小鼠和人血管,包括平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞。差異性表現(xiàn)為： mGluR5廣泛表達于大鼠和小鼠的小支氣管及終末細支氣管上皮,而在人肺組織小支氣管上皮及終末細支氣管上皮卻未見表達。mGluR5在鼠和人分布差異性主要表現(xiàn)在小支氣管和終末細支氣管,可能原因是： 人和鼠肺氣道上皮細胞組成有差異[9]。本研究采用的人肺組織來源于支氣管擴張患者正常肺組織,支氣管擴張病變結構呈肺段分布,未受累肺段可為正常肺組織,本研究采用的肺組織經(jīng)H-E染色觀察未見病理改變。然而,形態(tài)學提示正常,不能排除由于疾病引起的分子水平的變化,如能獲得健康人的正常肺組織,應進一步驗證。王昕[10]報道,人和小鼠胚胎肺組織在發(fā)育過程中BMP4和FGF10基因的表達模式存在差異性,提示人和小鼠在胎肺發(fā)育過程中存在不同的信號通路和調(diào)控過程。mGluR5在人和大鼠、小鼠肺組織中分布存在差異性,說明其在人和鼠肺組織中的mGluR5所介導的信號通路可能具有差異性。

mGluR5表達于大鼠、小鼠和人肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞。急性呼吸窘迫綜合征的病理特征是多種致病因素導致肺毛細血管內(nèi)皮細胞損傷和肺泡上皮細胞損傷,表現(xiàn)為肺血管通透性增高和肺泡腔液體滲出引起肺水腫及透明膜形成[11-12]。Bai等[13]報道,外周血谷氨酸水平升高與創(chuàng)傷性腦損傷引起的急性肺損傷呈正相關。在肺組織中,王銘杰等[14]通過支氣管肺泡灌洗顯示,正常肺組織存在一定量的谷氨酸釋放,高氧環(huán)境下肺組織中谷氨酸釋放增加,介導高氧性肺損傷。上述研究結果不僅表明外周血和肺組織局部谷氨酸水平增高參與急性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展,也表明肺組織中存在有功能性的谷氨酸受體,谷氨酸水平增高通過激活表達于肺組織中的谷氨酸受體介導的信號通路,參與肺損傷。Ferrigno等[15]報道,mGluR5抑制劑MPEP在小鼠肝體外缺血再灌注模型中起保護作用,提示mGluR5參與肝細胞缺血再灌注損傷。研究表明[16],mGluR5表達于腦微血管結構,激活mGluR5引起血管通透性增加。Chen等[17]報道,同型半胱氨酸通過激活mGluR5阻止小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的遷移。以上研究提示,mGluR5在決定肺泡毛細血管功能和功能障礙方面發(fā)揮作用。

本研究免疫組織化學顯色顯示,在人肺組織中,血管平滑肌細胞表達mGluR5。研究認為,特發(fā)性肺動脈高壓與肺血管內(nèi)皮和平滑肌功能障礙有關[18],而在慢性肺源性心臟病,肺動脈高壓形成主要原因是缺氧使平滑肌細胞膜對Ca2+的通透性增加,致肺血管平滑肌收縮[19]。mGluR5為G蛋白偶聯(lián)受體,許多研究已證實,mGluR5通過激活PLC-IP3-CaMK信號通路,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放,從而使細胞內(nèi)Ca2+增多[20]。因此,筆者推測,mGluR5可能通過激活平滑肌細胞鈣離子信號使肺血管平滑肌收縮增強,引起血管收縮,從而促進肺動脈高壓的發(fā)展。

谷氨酸通過結合相應的受體發(fā)揮不同的效應[21],從而參與調(diào)節(jié)多種肺部疾病[22-23]。肺分為實質(zhì)和間質(zhì)兩部分,不同結構的病理改變通過其對應的信號通路引起肺功能障礙。本研究明確了mGluR5在肺組織各級結構的表達及定位情況,顯示mGluR5在大鼠、小鼠和人肺組織中的分布具有種屬差異性,為進一步明確mGluR5在不同種屬肺組織中的功能提供了研究基礎。

圖版說明(圖見封三)

圖3 肺組織mGluR5免疫組織化學表達。A-D、a-d： 大鼠(圖a、b、c、d分別為圖A、B、C、D方框內(nèi)的放大圖,下同)；E-H、e-h： 小鼠；I-L、i-l： 人。A、a、E、e、I、i： 小支氣管,B、b、F、f、J、j： 終末細支氣管,C、c、G、g、K、k： 肺泡；D、d、H、h、L、l： 血管.

Explanationoffigures(See inside back cover)

Fig 3 Immunohistochemical analysis of mGluR5 expression in lung tissue. A-D, a-d： Rat (Figure a, b, c, and d were enlarged view in the block of figure A, B, C and D, respectively. The below was same); E-H, e-h： Mouse; I-L, i-l： Human. A, a, E, e, I, i： Small bronchiole; B, b, F, f, J, j： Terminal bronchiole; C, c, G, g, K, k： Pulmonary alveoli; D, d, H, h, L, l： Blood vessel.