鄭 璇， 申國明， 高 林， 張 鵬， 李琦瑤， 李盼盼， 劉新民

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物多與植物的抗逆性、抗病性相關(guān)，其合成和積累受環(huán)境因子影響。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，環(huán)境因子間的差異對中藥材道地性的形成起重要作用。在眾多環(huán)境因子中，土壤占較大比重[1]。因此，探究土壤主要化學(xué)指標(biāo)對植物次生代謝產(chǎn)物合成和積累的影響對藥材質(zhì)量評價(jià)具有重要意義。

皺皮木瓜是薔薇科植物貼梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai]的干燥近成熟果實(shí)，因其果實(shí)曬干后外表皮皺縮而得名。皺皮木瓜是一種重要的藥食同源植物，具有保肝、抗腫瘤以及抗炎鎮(zhèn)痛等功效[2]，在我國主要分布于安徽、湖北、云南、重慶、四川、浙江、貴州等地。木瓜中黃酮類物質(zhì)對皺皮木瓜藥理活性有重要的作用。近年來，對黃酮類物質(zhì)的研究開始成為熱點(diǎn)。黃酮類化合物可作為電子供體發(fā)揮抗氧化作用，從而有效降低腫瘤、心腦血管疾病等慢性病的發(fā)生[3]。目前，對皺皮木瓜的研究主要集中在不同產(chǎn)區(qū)[4]、不同采收期[5-6]木瓜藥材所含的化學(xué)成分以及對其活性成分的分離提取[7]，木瓜總黃酮與土壤化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，通過對不同產(chǎn)地皺皮木瓜總黃酮含量與土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、速效鉀含量、速效磷含量進(jìn)行相關(guān)分析，探究影響皺皮木瓜質(zhì)量的土壤因素，揭示土壤在道地藥材形成中的作用和不同產(chǎn)區(qū)皺皮木瓜差異形成的原因，為木瓜品質(zhì)評價(jià)和生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素對照品，純度95%，Adamas公司；福林-西奧卡特(Folin-Ciocalteu)試劑，Sigma公司；甲醇、乙醇，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉(NaNO2)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯化鋁(AlCl3)，阿拉丁公司。

SBL-30DT型超聲波恒溫清洗機(jī)，浙江寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan Fc型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾(上海)有限公司；BSA124S-C型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；FP6410型火焰光度計(jì)，上海精科分析儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵，河南鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料

供試皺皮木瓜樣品分別來自中國道地產(chǎn)區(qū)：安徽宣城、重慶綦江、湖北長陽、浙江淳安、云南臨滄，采樣于各產(chǎn)區(qū)木瓜采摘期進(jìn)行(2017年7—9月)。在各產(chǎn)區(qū)的果園內(nèi)隨機(jī)選取生態(tài)條件基本一致的同齡實(shí)生皺皮木瓜植株各5株，每個(gè)植株選取大小一致且成熟度相近的果實(shí)各3枚，將采集的木瓜樣品對半剖開，并在日光下暴曬10 d，粉碎、過篩(粒徑 0.25 mm)，干燥保存。采集相應(yīng)點(diǎn)的土樣，將土壤樣品置于干燥、通風(fēng)、潔凈的室內(nèi)陰干，剔除雜質(zhì)，撿去動植物殘?bào)w，將土壤研細(xì)，過篩(粒徑2 mm)，干燥保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 木瓜樣品總黃酮的提取和含量測定

1.3.1.1 提取方法 參考王曉麗的方法[8]并稍作改動。稱取木瓜樣品0.1 g于20 mL具塞玻璃管中，精確稱定，加入90%乙醇10 mL，混勻，于60 ℃下超聲(功率為360 W)50 min；過濾，殘?jiān)鶕?jù)以上方法再次提取1次，合并2次濾液，搖勻即得樣品提取液。

1.3.1.2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，選取槲皮素對照品溶液含量分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL。用酶標(biāo)儀于510 nm測量吸光度。以槲皮素含量(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(D)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為D=0.495C+0.035 7(r2=0.999)。槲皮素對照品溶液在0.1～1.2 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖1)。

1.3.1.3 總黃酮含量測定 吸取10 μL 50 mg/mL亞硝酸鈉(NaNO2)溶液于96孔板中，加入50 μL待測液，充分混勻后于室溫下反應(yīng)5 min，加入10 μL 100 mg/mL的氯化鋁(AlCl3)溶液，充分混勻，室溫反應(yīng)1 min，最后加入100 μL 0.5 mol/L 氫氧化鈉(NaOH)溶液，用酶標(biāo)儀于510 nm處測定吸光度。通過標(biāo)準(zhǔn)方程得出樣品中的總黃酮含量。

1.3.2 土壤主要化學(xué)指標(biāo)的測定 土壤主要化學(xué)指標(biāo)的測定方法參照常規(guī)土壤化學(xué)分析方法進(jìn)行測定[9]。土壤pH值在5 ∶1水土比的土壤懸濁液中用酸度計(jì)測定；全氮含量采用凱氏定氮法測定；速效鉀含量采用醋酸銨-火焰光度計(jì)法測定；速效磷含量采用0.5 mol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)浸提-鉬銻抗比色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statiscal Analysis System 9.2進(jìn)行相關(guān)性分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)木瓜總黃酮含量測定

本試驗(yàn)表明，在所選的5個(gè)產(chǎn)區(qū)中，各產(chǎn)區(qū)木瓜的總黃酮含量差異較大(圖2)，其中云南臨滄的木瓜總黃酮含量最高，為(34.79±0.20) mg/g，這與王有為等的研究結(jié)果[10]類似；重慶綦江的木瓜總黃酮含量最低，為(6.32±0.60) mg/g。這表明木瓜黃酮含量的積累與產(chǎn)區(qū)相關(guān)。木瓜總黃酮含量的差異顯示不同產(chǎn)區(qū)的木瓜質(zhì)量可能有所不同。俞佳比較了7個(gè)產(chǎn)區(qū)(四川、湖北、安徽、云南、貴州、浙江、廣元)皺皮木瓜的總黃酮含量，其中四川、浙江、廣元這3個(gè)地區(qū)木瓜總黃酮含量較高[11]。不同的試驗(yàn)方法、采樣時(shí)期、采樣地點(diǎn)等因素都會造成木瓜總黃酮含量的差異。因此，不同產(chǎn)區(qū)木瓜總黃酮含量并不是一成不變的，藥材的道地性可能受多種因素共同影響。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)土壤主要化學(xué)指標(biāo)測定

木瓜不同產(chǎn)區(qū)土壤的pH值、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、速效鉀含量、速效磷含量均存在一定差異(表1)。皺皮木瓜種植地區(qū)土壤呈中性或弱酸性，各樣地土壤有機(jī)質(zhì)含量最高為最低的5.85倍，全氮含量最高為最低的為4.84倍，速效鉀含量最高為最低的為30.91倍，速效磷含量最高為最低的為15倍。土壤氮、磷、鉀的含量與植物的生長密切相關(guān)，重慶、浙江、湖北全氮含量較高，安徽、云南速效鉀含量較高，安徽地區(qū)速效磷含量較高。不同產(chǎn)區(qū)土壤之間的差異，說明皺皮木瓜適應(yīng)力強(qiáng)，適于人工集約化栽培。

在各種環(huán)境因子中，土壤對藥材質(zhì)量的影響起到了不可忽視的作用[12]，植物體內(nèi)次生代謝物的產(chǎn)生和運(yùn)輸直接或間接受到土壤因子的影響。在不同產(chǎn)區(qū)，即使栽培措施和氣候條件相同，土壤環(huán)境的不同也會造成植物體內(nèi)代謝產(chǎn)物不同。一些植物次生代謝產(chǎn)物會受到土壤pH值的影響[13]，有機(jī)質(zhì)含量是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)，土壤中的速效鉀[14]、全氮、速效磷等含量均會影響植物中總黃酮的含量?？阻吹染x用了本試驗(yàn)選取的幾種指標(biāo)作為評價(jià)黃酮和木瓜質(zhì)量的影響因子[15-16]，因此本試驗(yàn)選取的化學(xué)指標(biāo)可較好地評價(jià)皺皮木瓜的質(zhì)量。

表1 不同產(chǎn)區(qū)土壤主要化學(xué)指標(biāo)

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同產(chǎn)區(qū)之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 總黃酮含量與土壤主要化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

通過分析總黃酮含量與土壤各因子之間的相關(guān)性可以揭示各指標(biāo)間的聯(lián)系。本試驗(yàn)選取具有代表性的5種土壤化學(xué)指標(biāo)(pH值、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、速效鉀含量和速效磷含量)，它們可較好地反映土壤肥力的狀況。由表2可知，總黃酮含量與土壤中有機(jī)質(zhì)含量、速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與全氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與速效磷的含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。因此， 皺皮木瓜總黃酮含量受土壤中多個(gè)因子的共同影響。

表2 總黃酮含量與5個(gè)土壤化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)

注：*、**代表相關(guān)顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

藥用植物所接受到的光照、溫度、水分和土壤等因素會對植物的長產(chǎn)生重要的影響。土壤因子影響植物的次生代謝物的合成和積累，進(jìn)而影響藥材品質(zhì)。不同植物對土壤pH值的響應(yīng)不同。在某些植物中，土壤pH值與活性成分含量無明顯相關(guān)性[17]；本試驗(yàn)結(jié)果中，土壤pH值對木瓜總黃酮含量無顯著影響。土壤中有機(jī)質(zhì)可以促進(jìn)土壤微生物生長，進(jìn)而活化土壤養(yǎng)分，土壤中有機(jī)質(zhì)含量的提高有利于總黃酮的代謝積累；本試驗(yàn)中，土壤中的全氮含量與總黃酮含量呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明土壤中全氮含量越多，越不利于皺皮木瓜總黃酮的合成和積累，這與“碳素/營養(yǎng)平衡假說”中的觀點(diǎn)[18]一致，即環(huán)境中的碳/氮(C/N)比可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成和積累，一些以氮為基礎(chǔ)的次生代謝產(chǎn)物與植物體內(nèi)的碳氮比呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，一些以碳、氫、氧為基礎(chǔ)的與碳氮比呈正相關(guān)關(guān)系[19]。植物中的一些營養(yǎng)元素主要來源于土壤，因此土壤對植物氮素的供應(yīng)量也會影響植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)的積累。大量研究表明，土壤中氮含量低時(shí)更有利于次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[20]。本試驗(yàn)中，土壤中的速效鉀和速效磷含量與木瓜中總黃酮含量呈正相關(guān)。栽培過程中合理施肥，在一定范圍內(nèi)增加土壤中鉀和磷的含量，可以在一定程度上提高木瓜的抗逆性和對外界環(huán)境的適應(yīng)能力[21]，同時(shí)增加木瓜中總黃酮的含量。

2.4 回歸模型的建立

為建立總黃酮含量與其他各土壤化學(xué)指標(biāo)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，本試驗(yàn)以總黃酮含量(TF)為因變量、以各土壤化學(xué)指標(biāo)為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，得到方程：

TF=3.984+1.177OM+62.223AK(P<0.01)。

(1)

式中：OM為有機(jī)質(zhì)含量，AK為速效鉀含量，復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 4，F(xiàn)=1 668.51。

由公式(1)可知，在5個(gè)土壤化學(xué)指標(biāo)中有2個(gè)指標(biāo)對皺皮木瓜總黃酮含量有顯著影響，分別是有機(jī)質(zhì)含量和速效鉀含量，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，表明了土壤化學(xué)指標(biāo)對木瓜黃酮含量的影響，說明以上2個(gè)指標(biāo)可較好地解釋總黃酮的含量。

將土壤化學(xué)指標(biāo)與總黃酮含量通過逐步回歸分析得到了2個(gè)顯著影響皺皮木瓜總黃酮含量的單項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)得到總黃酮含量評價(jià)數(shù)學(xué)模型，可預(yù)測不同產(chǎn)區(qū)皺皮木瓜總黃酮含量的差異，這對皺皮木瓜品質(zhì)評價(jià)有一定科學(xué)性和預(yù)見性。

皺皮木瓜是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，藥用歷史悠久，而且作為一種功能食品具有很大的發(fā)展?jié)摿?，它營養(yǎng)、藥用價(jià)值豐富，現(xiàn)已開發(fā)出木瓜酒、木瓜果脯[22]等廣受消費(fèi)者喜愛的食品。皺皮木瓜種植適應(yīng)性強(qiáng)，適合在多數(shù)地區(qū)種植[23]，然而目前對皺皮木瓜質(zhì)量的影響因子缺乏深入研究[24]，從而不能對木瓜的科學(xué)管理提供技術(shù)支持，這在一定程度上限制了木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，木瓜總黃酮含量與土壤中的有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀含量密切相關(guān)。除pH值和全氮含量外，其他3個(gè)化學(xué)指標(biāo)均與總黃酮含量呈正相關(guān)。這與吳丹等對魚腥草的研究結(jié)果[25]類似。覃容貴等對寬葉纈草總黃酮含量與根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，總黃酮含量與有機(jī)質(zhì)、速效鉀和速效磷含量呈負(fù)相關(guān)[26]，與全氮含量呈正相關(guān)，這可能與植物的種類有關(guān)，也可能是因?yàn)橐欢l件下對藥材生長發(fā)育有利的土壤條件對于次生代謝產(chǎn)物的積累反而不利[27]。

筆者通過木瓜總黃酮含量與土壤主要化學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)對木瓜品質(zhì)的提高提出建議：皺皮木瓜的生長適合偏酸性或中性的土壤，在栽培過程中合理施肥，適當(dāng)?shù)囟嗍┝追省⑩浄?，培肥地力，控制土壤中氮肥的用量，疏松土壤，增加土壤酶活性和微生物比例，對于木瓜品質(zhì)有較好改善。

3 結(jié)論

采用紫外分光光度法測定5個(gè)產(chǎn)區(qū)皺皮木瓜的總黃酮含量，其中云南臨滄產(chǎn)區(qū)木瓜總黃酮含量最高，其次為安徽宣城、湖北長陽、浙江淳安，重慶綦江最低。通過相關(guān)分析可以看出，木瓜總黃酮含量與有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)，與速效磷含量呈顯著正相關(guān)，與全氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。有機(jī)質(zhì)、速效鉀含量可作為評價(jià)木瓜總黃酮含量的參考指標(biāo)。不同產(chǎn)地間皺皮木瓜總黃酮含量的差異是產(chǎn)地間生境土壤和其他生態(tài)因子的不同以及遺傳變異共同作用的結(jié)果，植物體內(nèi)代謝物質(zhì)的合成及積累也與植物自身發(fā)生的生理生化變化有關(guān)，對總黃酮含量的影響是多因素綜合作用的結(jié)果，本試驗(yàn)測定了不同產(chǎn)區(qū)總黃酮含量與土壤條件的差異，探明了土壤的5種化學(xué)指標(biāo)對木瓜總黃酮含量影響，為以后更深入研究影響木瓜質(zhì)量的相關(guān)因子提供了借鑒和基礎(chǔ)。