劉 祥，孫東玲，卓素卿，歐陽明安

(福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，福建福州 350000

蓮瓣蘭(Cymbidiumtortisepalum)別稱菅草蘭、卑亞蘭、小雪蘭[1]，為蘭科蘭屬多年生草本植物。曾被歸入春蘭之下作為變種，但因兩者形態(tài)差異較大，最終恢復承認蓮瓣蘭為獨立的種[2]?！吧彴辍笔菍μm花瓣型的描述，蓮瓣蘭的花形像荷花，蓮瓣即荷瓣，故因此得名[3]。蓮瓣蘭原產(chǎn)于云南西北部的三江并流流域，分布范圍十分狹窄，主要見于滇西北、川西南和臺灣等地[4]。一般生長在常綠松櫟林和灌木混交林下，土壤中性，喜背陰坡和疏松的腐質(zhì)土[5]，是中國傳統(tǒng)蘭花中最具云南特色的品種。

20世紀80年代起，以韓、日和我國臺灣為中心的東南亞國家和地區(qū)蘭市暴熱，1株中檔國蘭的價值在數(shù)百至數(shù)千元人民幣之間，珍稀蘭花價值更逾百萬元，蓮瓣蘭作為國產(chǎn)蘭屬中的重要一員，逐漸被國內(nèi)蘭界所熟知。目前已形成素花、奇花、瓣型花、復色花、線藝、矮種等系列的優(yōu)良品種[6]，因其葉態(tài)多姿(直立或半直立)，葉長和葉寬有較大差異，花色豐富(白色、綠色、紅色、黃色等)，瓣型各異[7]，深受中國、日本、韓國和東南亞等國家人民的喜愛，具有極高的觀賞價值、文化價值和經(jīng)濟價值。

但是由于全球“蘭花熱”和經(jīng)濟利益驅(qū)使，近20年，瓣蘭種質(zhì)資源遭到了毀滅式采挖[8]，導致其數(shù)量急劇減少，自然界中很難再找到開花的成年植株。生存環(huán)境的破壞導致其無法在自然界中正常地繁衍和生存，野生種質(zhì)資源瀕臨滅絕。而蓮瓣蘭種子的胚多發(fā)育不完全或不成熟，甚至不含胚乳，因此直接用種子萌發(fā)來獲得植株較為困難[9]。而傳統(tǒng)的分株繁殖，種苗增殖緩慢，分株移栽過程易被病毒感染，品種退化嚴重[10]，因此采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進行快速大量繁殖，對于解決蓮瓣蘭繁殖系數(shù)低等問題，同時推動大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)是一種極為可行的方法。本試驗以蓮瓣蘭大雪素為母本，墨蘭為父本進行雜交，產(chǎn)生的后代根狀莖為材料，研究不同因素對雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖的影響，并對其進行分子鑒定，以期為提高蓮瓣蘭育種質(zhì)量和大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為雜交蓮瓣蘭蒴果，其由父本墨蘭(Cymbidiumsinense)的花粉涂抹于母本蓮瓣蘭大雪素(Cymbidiumtortisepalum‘Daxuesu’)的子房柱頭上并套袋發(fā)育獲得(2014年12月人工授精，2015年7月獲得蒴果，地點在福建農(nóng)林大學英龍2號樓天臺)。

1.2 方法

1.2.1 雜交根狀莖的誘導 將蒴果表面消毒后剖開，取出蘭花種子撒在1/2 MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照度2 400 lx，時間12 h/d，濕度75%，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進行擴增，為后續(xù)試驗積累材料。

1.2.2 不同基本培養(yǎng)基對根狀莖增殖的影響 根狀莖的增殖是蓮瓣蘭快速繁殖的關(guān)鍵，而基本培養(yǎng)基的成分則會直接影響到根狀莖的生長狀況，試驗選取了MS、1/2MS、B5、N6共4種培養(yǎng)基進行比較，培養(yǎng)基中另外添加1 mg/L萘乙酸(NAA)+1 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)+30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。在無菌條件下，將根狀莖掰成小塊放入培養(yǎng)基中，每瓶放4根，每個處理重復5次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.3 不同NAA濃度對根狀莖增殖的影響 試驗在N6基本培養(yǎng)基上進行，設(shè)置6-BA的濃度為1.0 mg/L固定不變，激素NAA的濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mg/L，培養(yǎng)基中另外添加30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.4 不同6-BA濃度對根狀莖增殖的影響 試驗在N6基本培養(yǎng)基上進行，設(shè)置NAA的濃度為1.0 mg/L固定不變，激素6-BA的濃度梯度為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，培養(yǎng)基中另外添加30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.5 不同碳源對根狀莖增殖的影響 培養(yǎng)基中添加糖類是為植物組織細胞生長提供碳源，也可以提高培養(yǎng)基的滲透壓。本試驗對蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、麥芽糖6種糖類進行篩選，濃度均為30 g/L，并以試驗得到的最佳基本培養(yǎng)基N6和最佳激素搭配0.5 mg/L NAA+0 mg/L 6-BA為定值，另外添加1 g/L活性炭+1 g/L胰蛋白胨+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復5次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.6 不同有機添加物對根狀莖增殖的影響 蘭花組織培養(yǎng)過程中常常添加一些天然有機物，這些有機物成分復雜，研究表明，它們對根狀莖的增殖和分化有明顯的促進作用[11]。試驗選取了椰子汁、蘋果汁、馬鈴薯勻漿、西紅柿勻漿、蛋白胨和胰蛋白胨6種天然復合物進行測試，其添加濃度分別為椰汁100 mL/L、蘋果汁100 mL/L、馬鈴薯勻漿100 g/L、西紅柿勻漿100 g/L、蛋白胨1 g/L、胰蛋白胨1 g/L。培養(yǎng)基中其他成分為N6+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+7 g/L 瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.7 不同活性炭濃度對根狀莖增殖的影響 組織培養(yǎng)中添加活性炭有吸附有毒代謝物和調(diào)節(jié)激素釋放的作用，可以有效促進植物的生長。本試驗測試0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L 共6個活性炭濃度水平，培養(yǎng)基中其他成分為N6+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。每瓶放置4根材料，每個處理重復4次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量和根狀莖分枝數(shù)。

1.2.8 不同激素濃度搭配對根狀莖分化的影響 前人研究表明選用恰當?shù)闹参锛に嘏浔葘Ω鶢钋o的分化起著主導作用[12]。本試驗選取9個激素組合探究對根狀莖發(fā)芽的影響(表1)，培養(yǎng)基中其他成分為N6+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。每瓶放置5根材料，每個處理重復4次，培養(yǎng)前后記錄鮮質(zhì)量、根狀莖分化個數(shù)和總出芽數(shù)。

表1 分化試驗激素組合

1.2.9 試驗培養(yǎng)基條件及統(tǒng)計分析計算方式 以上“1.2.2”節(jié)至“1.2.8”節(jié)試驗中的培養(yǎng)基pH值5.4～5.8，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，相對濕度70%～80%，光照度2 400 lx，增殖過程光照時間12 h/d，培養(yǎng)時間為30 d，分化過程光照時間14 h/d，培養(yǎng)時間為120 d(時間從2016年3月至2017年4月，在福建農(nóng)林大學英龍2號樓2樓植物組培室進行)。實驗分析計算公式具體如下：

增殖率=(培養(yǎng)后分枝數(shù)-培養(yǎng)前分枝數(shù))/培養(yǎng)前分枝數(shù)×100%；

鮮質(zhì)量增長率=(培養(yǎng)后鮮質(zhì)量-培養(yǎng)前鮮質(zhì)量)/培養(yǎng)前鮮質(zhì)量×100%；

分化率=分化根狀莖數(shù)/5×100%；

平均出芽數(shù)=總出芽數(shù)/根狀莖分化個數(shù)。

1.2.10 雜交蓮瓣蘭的分子鑒定 取根狀莖誘導長出的小苗葉片作材料，通過植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因，并擴增其ITS片段，PCR體系如表2所示。

表2 PCR反應體系的組成

然后通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物，可用后進行回收，樣品送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序。最終將測序結(jié)果放在NCBI網(wǎng)站上進行比對，并下載10個相近的序列運用MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹探究其親緣關(guān)系。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用Excel進行記錄，采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析并作圖，采用Duncan’s新復極差法進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交根狀莖的誘導

蘭花種子內(nèi)的球形胚發(fā)育不完全且無胚乳，加之致密種皮的透性差和種皮上含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)，自然條件下萌發(fā)困難。本試驗將蘭花種子撒在培養(yǎng)基上控溫控濕，一段時間后種子吸水開始膨脹，在150～180 d內(nèi)觀察到種子萌發(fā)并逐漸形成根狀莖，接著將根狀莖轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基上進行擴增(圖1)。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對根狀莖增殖的影響

將根狀莖接種在不同基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，可以肉眼觀察到根狀莖上新長出的白色或綠色的幼嫩側(cè)枝，這說明不同培養(yǎng)基中的根狀莖均有側(cè)枝增加。通過對培養(yǎng)前后鮮質(zhì)量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，由圖2可知，在4種基本培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，無論是根狀莖增殖率還是鮮質(zhì)量增長率的差異都比較明顯。在1/2MS上培養(yǎng)的根狀莖增殖率最高，說明此培養(yǎng)基能夠有效促進根狀莖側(cè)枝的生長，但是與N6培養(yǎng)基相比差異并不顯著，另外其鮮質(zhì)量增長率最低，可以說明1/2MS不利于根狀莖質(zhì)量的增加。在N6培養(yǎng)基上培養(yǎng)的根狀莖鮮質(zhì)量增長率在4種基本培養(yǎng)基中最高，說明其有利于根狀莖的增粗增大，增殖率方面比1/2MS略少，但差異不大，其他2種培養(yǎng)基MS和B5促進根狀莖側(cè)枝和鮮質(zhì)量增加的效果均一般，所以綜合2種生長指標來看，N6培養(yǎng)基為最佳選擇。

2.3 不同NAA濃度對根狀莖增殖的影響

生長素在根狀莖增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。本試驗設(shè)置6-BA為固定濃度，研究NAA不同濃度下根狀莖的生長情況。從數(shù)據(jù)分析得出的折線圖(圖3)可以看出，根狀莖的增殖率和鮮質(zhì)量增長率隨著NAA濃度的不斷增大呈現(xiàn)出明顯的波動狀態(tài)。在不同處理中，當NAA濃度為 0.5 mg/L 時，根狀莖鮮質(zhì)量增長率最高，說明在此條件下根狀莖增粗增大的幅度最大，此濃度最有利于根狀莖有機物質(zhì)的積累，但增殖率較低，說明不利于側(cè)芽的生長，與此情況相近的濃度為5.0 mg/L，其增殖率和鮮質(zhì)量增長率與0.5 mg/L水平差異并不明顯。當NAA濃度為4.0 mg/L時，根狀莖增殖率最高，其鮮質(zhì)量增長率較之其他濃度一般，那么在培養(yǎng)過程中，可以根據(jù)需求的不同選擇相應的生長素濃度，以便對根狀莖有側(cè)重地進行培養(yǎng)。

2.4 不同6-BA濃度對根狀莖增殖的影響

細胞分裂素搭配生長素使用可以更好地促進根狀莖的增殖。本試驗設(shè)置NAA為固定濃度，選取6個不同的6-BA濃度水平，測定其不同濃度對根狀莖增殖的影響。圖4顯示，增殖率和鮮質(zhì)量增長率都隨著6-BA濃度的改變而呈現(xiàn)出相似的趨勢，即6-BA濃度小于2.0 mg/L時，整體上為下降趨勢，6-BA濃度為2.0 mg/L時，增殖率和鮮質(zhì)量增長率均為最低，6-BA濃度>2.0 mg/L后，增殖率和鮮質(zhì)量增長率開始增加。整體看，無論是增殖率還是鮮質(zhì)量增長率都以 6-BA 濃度為0時最佳，只是鮮質(zhì)量增長率與濃度0.5、1.0 mg/L 水平相比差異不顯著，但增殖率卻達到了極顯著差異(P<0.01)，說明雜交蓮瓣蘭根狀莖的培養(yǎng)只添加NAA即可，6-BA的存在會不同程度地降低增殖效率。

2.5 不同碳源對根狀莖增殖的影響

蘭花組織培養(yǎng)中應用較多的是蔗糖和葡萄糖，添加糖類物質(zhì)主要是增加培養(yǎng)基中的滲透壓，本試驗除了這2種外，又增加了乳糖、果糖、木糖和麥芽糖4種碳源進行測試。圖5顯示，6種碳源中果糖對雜交蓮瓣蘭根狀莖的側(cè)枝和鮮質(zhì)量的促進作用均為最佳，這與前人關(guān)于碳源對根狀莖增殖影響的研究結(jié)果有所不同，可能跟蓮瓣蘭的植物特性以及雜交因素相關(guān)。另外側(cè)枝增加效果接近果糖的碳源分別為蔗糖和葡萄糖，但是培養(yǎng)基中添加蔗糖和葡萄糖，蓮瓣蘭根狀莖鮮質(zhì)量增長率與果糖相比差距較大，而蔗糖和葡萄糖2種糖類間差異并不顯著。增殖效果最差的為乳糖，增殖率和鮮質(zhì)量增長率均為最低。

2.6 不同有機添加物對根狀莖增殖的影響

天然復合物的成分一般比較復雜，以往的研究發(fā)現(xiàn)這些外來添加物可以有效地促進蘭花組織增殖。本試驗測試了椰汁、蘋果汁、馬鈴薯、西紅柿、蛋白胨和胰蛋白胨6種天然復合物，并設(shè)置1個空白對照(不添加復合物)。由圖6可以看出，在添加蛋白胨的培養(yǎng)基上生長的根狀莖增殖率最高，說明培養(yǎng)材料分枝最多，其次為空白對照，兩者差異不顯著，而空白對照的鮮質(zhì)量增長率最高，說明在此條件下根狀莖有機物積累速度最快，生長粗壯，不過與蛋白胨相比差異也不顯著。

總體看，不加任何天然復合物的培養(yǎng)基對根狀莖增殖效果最佳，而添加了復合物的培養(yǎng)基其促增殖作用大部分有不同程度的降低，說明添加復合物對此雜交蓮瓣蘭根狀莖不利，對其生長會產(chǎn)生一定的阻礙作用，雖然蛋白胨、胰蛋白胨和椰汁等與空白對照的增殖效果相近，但考慮培養(yǎng)成本因素，最終確定不添加任何天然復合物為最佳條件。

2.7 活性炭不同濃度對根狀莖增殖的影響

活性炭對于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中有機物和植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度具有十分重要的作用，本試驗設(shè)置了6個濃度梯度測試其對根狀莖增殖的影響。從圖7可以看出，蓮瓣蘭根狀莖增殖率和鮮質(zhì)量增長率隨著活性炭濃度的提高也發(fā)生較大的波動，不加活性炭時根狀莖鮮質(zhì)量增長率最高而增殖率最低，表明在此條件下根狀莖有機物積累快但側(cè)枝增長較少?；钚蕴繚舛葹?.0 g/L時根狀莖側(cè)枝生長最快，其鮮質(zhì)量增長速度略低于不加活性炭時的水平，且差異不顯著，其他活性炭濃度下，根狀莖的生長均處于一般水平，因此培養(yǎng)基中添加活性炭的最適濃度應為5.0 g/L。

2.8 不同激素濃度搭配對根狀莖分化的影響

目前最常用的激素是生長素和細胞分裂素，不同的濃度、種類和組合所起的作用不同。有關(guān)資料顯示，蘭花培養(yǎng)材料的分化一般需要較低濃度的生長素和高濃度的細胞分裂素搭配。本試驗設(shè)置了9組激素配比進行測試，圖8和圖9分別表示不同激素配比組合對雜交蓮瓣蘭根狀莖增殖和分化的影響。從圖8中可以看出組合二(0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA)的分化率最高，接近100%，說明此種激素配比對根狀莖分化影響最為顯著，可以有效地促進雜交蓮瓣蘭根狀莖快速發(fā)芽，其次是組合一(0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA)和組合三(0.5 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA)的分化率較高，組合二與組合一差異不顯著，與組合三差異顯著(P<0.05)。另外從圖8上看前3個組合的分化率明顯比其他組合高很多，而它們的NAA濃度都為0.5 mg/L，說明較低濃度的NAA有利于雜交蓮瓣蘭的分化，這與前人研究結(jié)果相一致。結(jié)合圖9可知，組合二的平均出芽數(shù)也較高，與最高者差異不顯著，所以確定組合二為最佳促分化激素搭配。圖9顯示組合九(2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA)平均出芽數(shù)最高，說明高濃度的激素搭配能促使單個根狀莖分化時出芽數(shù)量多，所以可以考慮將已經(jīng)分化的根狀莖轉(zhuǎn)移到添加此激素配比的培養(yǎng)基上促進芽數(shù)量的增加，最終達到蓮瓣蘭苗又快又好生長發(fā)育的目的。

2.9 雜交蓮瓣蘭的分子鑒定

提取的DNA經(jīng)過通用引物ITS1和ITS4擴增后，其ITS片段擴增電泳圖見圖10。圖10顯示雜交蓮瓣蘭的ITS片段大小接近750 bp，擴增的產(chǎn)物可以直接從PCR反應液中回收，然后送至鉑尚生物技術(shù)有限公司測序，獲得相應序列，正向序列大小為698 bp，反向序列大小為723 bp。登陸NCBI網(wǎng)站Blast并下載相近序列， 再使用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖11)。網(wǎng)站搜索顯示最近的序列其相似度僅為96%，從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上看此雜交種與選取的10種蘭花都不在同一分支上，說明與它們的親緣關(guān)系較遠，而本株蘭花是由蓮瓣蘭和墨蘭接種雜交而成，之所以造成這種現(xiàn)象應該與雜交后代基因發(fā)生較大改變有關(guān)，總體說明此植株應為雜交后代。

3 討論與結(jié)論

不同種蘭花材料進行組織培養(yǎng)所需要的基本培養(yǎng)基和激素等物質(zhì)是不同的，而同一種蘭花材料在不同培養(yǎng)階段需要的培養(yǎng)條件也不盡相同，因此對于具體的蘭花品種及材料，培養(yǎng)條件的篩選是一項十分艱巨的任務。在蘭花組織培養(yǎng)方面，通常對于春蘭、寒蘭、建蘭和墨蘭等研究較多，而對蓮瓣蘭的研究相對偏少，對于雜交品種的研究相比純種也較少，所以往往在這些方面缺乏參考的依據(jù)。另一方面，由于蘭花種子萌發(fā)率低[13]，苗株生長周期長等問題制約了蘭花的工廠化生產(chǎn)，雜交不失為一種生產(chǎn)新品種的手段，但是親緣關(guān)系近的品種間容易雜交成功，而親緣關(guān)系遠的品種間就不容易獲得成功[14]。在蘭花組織培養(yǎng)過程中，基本培養(yǎng)基和激素對其影響往往最大，前人對其研究也最多[15]，其次就是碳源、添加物和活性炭等方面，所以要找出最優(yōu)組織培養(yǎng)條件，任重而道遠。

本試驗選取基本培養(yǎng)基，從NAA、6-BA、碳源、有機添加物和活性炭共6個方面進行最佳培養(yǎng)條件的篩選。綜合考慮增殖率、鮮質(zhì)量增長率、分化率和平均出芽數(shù)4個生長指標，確定N6培養(yǎng)基為最佳基本培養(yǎng)基；NAA濃度為0.5 mg/L有利于根狀莖鮮質(zhì)量的增加，為4.0 mg/L則有利于側(cè)枝的生長；對碳源的選取以果糖效果最佳，這與以往的研究結(jié)果相比差異較大，可能跟植株的品種不同相關(guān)；不加天然復合物既有利于雜交蓮瓣蘭根狀莖的增殖，又可以節(jié)約培養(yǎng)成本；活性炭濃度為5.0 g/L可以高效地促進根狀莖的生長；0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA激素組合能夠使根狀莖快速分化，2.0 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA激素組合可以使分化的根狀莖產(chǎn)生更多的芽，2個激素組合如果在誘芽過程中搭配使用效果更好，最終可獲得大量的幼苗，為后續(xù)移栽和誘花研究提供豐富的材料。雜交蘭苗株的形態(tài)往往表現(xiàn)出父本和母本中和或者偏向于某一親本的現(xiàn)象，由于周期較長，本試驗未能從花型等特征進行辨別，而選取分子鑒定手段確定其為雜交品種。