蘇聰聰， 金 燕， 徐 豐， 白 描， 石雪暉， 楊國順， 鐘曉紅， 劉昆玉， 陳陳恒， 李含晰

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/湖南省葡萄工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128

刺葡萄(VitisdavidiiFoex)是葡萄科葡萄屬東亞種群的一個(gè)特色野生葡萄種質(zhì)資源[1]，可作為釀酒和制汁的優(yōu)質(zhì)原料。但目前栽培刺葡萄品種或類型存在果實(shí)含糖量偏低與果實(shí)香氣不明顯的缺陷。因此，選擇風(fēng)味獨(dú)特、果香濃郁的歐亞種或歐美雜種葡萄品種如玫瑰香、金手指、香妃等，與其進(jìn)行種間雜交，以改良刺葡萄品質(zhì)，培育出優(yōu)質(zhì)的刺葡萄新品種。

在雜交過程中，由于葡萄可能受外源花粉污染或因閉花受精自交結(jié)實(shí)等原因，可能造成雜交后代真假雜種苗混雜，因此對(duì)雜種后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定是后期遺傳研究的前提。用于植物雜交后代的鑒定方法，主要有植株形態(tài)學(xué)[2]、細(xì)胞學(xué)、同工酶學(xué)[3]以及分子標(biāo)記[4]等方法。分子標(biāo)記鑒定技術(shù)可從DNA水平上揭示雜交子代與父母本間的遺傳差異。SSR即簡單重復(fù)序列，其分布于整個(gè)基因組，多態(tài)性高，且呈共顯性遺傳，由此開發(fā)作為分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單，是雜種后代鑒定的常用手段。樊秀彩等應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)山葡萄與河岸葡萄的雜種后代進(jìn)行了成功鑒定[5]。朱駿馳等以SSR分子標(biāo)記鑒定了玫瑰香與紅地球葡萄的雜交后代[6]。Martinez等運(yùn)用SSR標(biāo)記研究葡萄種內(nèi)或種間的多態(tài)性及雜交子代鑒定，均認(rèn)為SSR標(biāo)記特異性強(qiáng)[7-8]。本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)刺葡萄的F1代雜種進(jìn)行真實(shí)性鑒定，旨在為提高刺葡萄雜交育種效率奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2013年5月采用常規(guī)雜交方法，選擇刺葡萄與玫瑰香、金手指等歐亞種及歐美雜種葡萄品種雜交，共6個(gè)不同雜交組合，供試的親本及雜交實(shí)生后代的64個(gè)單株，栽植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄基地，取幼嫩葉片保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 以葡萄嫩葉為材料進(jìn)行基因組DNA的提取，由于葡萄尤其刺葡萄葉片富含有機(jī)酸、多酚、多糖等物質(zhì)，在參考Lian等改良CTAB法[9-10]的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了改進(jìn)，選擇將CTAB提取液的pH值由8調(diào)至9.5，DNA質(zhì)量明顯提高。提取的DNA在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用Eppendorf公司生產(chǎn)的Bio-Photometerplus核酸定量儀檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度，并將濃度稀釋至30 ng/μL。

1.2.2 SSR反應(yīng)體系優(yōu)化、引物合成及PCR擴(kuò)增 SSR反應(yīng)體系從影響反應(yīng)的5個(gè)因素：Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq酶濃度、模板DNA濃度、引物濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)比較，篩選出最優(yōu)體系水平，即Mg2+2.0 mmol/L，dNTPs 0.1 mmol/L，Taq聚合酶 1 U/L，模板DNA 30 ng/L，引物 0.5 μmol/L。各個(gè)因素濃度梯度見表1。

表1 SSR反應(yīng)體系中的因素水平

參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]中所用引物，試驗(yàn)所用15對(duì)SSR引物序列(表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，試驗(yàn)采用20 μL反應(yīng)體系：基因組DNA 30 ng，dNTPs(0.1 mmol/L)，引物(0.5 μmol/L)，Mg2+(2.0 mmol/L)，Taq聚合酶 1 U，10×buffer 2.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)閿U(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，51 ～ 61 ℃退火15 s，73 ℃ 延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；89 ℃變性15 s，51～61 ℃退火15 s，73 ℃延伸1 min，23個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 9902 PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，用相機(jī)拍照記錄。

1.2.3 雜種SSR鑒定 利用15對(duì)SSR引物進(jìn)行親本間的多態(tài)性分析，選擇擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定、主帶明顯、雙親中表現(xiàn)出多態(tài)性的引物作為雜種鑒定的引物。每對(duì)引物重復(fù)試驗(yàn)3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 SSR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

對(duì)雙親及64份雜交后代共70份材料的DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，所提取DNA的D260 nm/D280 nm值均介于1.7～1.9 之間。由圖1可知，使用改良方法提取的DNA為1條清晰完整的條帶，沒有明顯拖尾，無蛋白質(zhì)和RNA污染。表明改良的CTAB法提取的DNA完整，純度高，符合本試驗(yàn)的要求。

2.2 引物篩選

將SSR引物組合在雙親中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物在親本中檢測(cè)出的多態(tài)性條帶為1～2個(gè)。經(jīng)過多次重復(fù)，篩選出其中條帶清晰、穩(wěn)定的引物，最終確定了在雙親中均有多態(tài)性的VrZAG83和VrZAG62引物用于雜種后代的鑒定及驗(yàn)證(圖2)。

2.3 雜種后代的SSR鑒定結(jié)果

根據(jù)引物篩選結(jié)果，分別選擇引物VrZAG83和VrZAG62對(duì)64株雜種后代進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果見圖3、圖4。后代中能擴(kuò)增出父母本特異性條帶的認(rèn)定，為真實(shí)性雜種，因?yàn)镾SR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記。由圖3和圖4可知，泳道11、39只擴(kuò)增出母本特異性條帶，均未擴(kuò)增出父本特異性條帶，可能為母本自交后代；泳道42在使用引物VrZAG83時(shí)，除擴(kuò)增出1條母本特異條帶外，還擴(kuò)增出1條未知來源條帶，但在使用引物VrZAG62時(shí)，僅擴(kuò)增出1條母本特異條帶，可能為外源花粉污染所致，或者為母本自交后代。64個(gè)F1雜交后代群體中出現(xiàn)包含有父母本特異條帶的個(gè)體共有60個(gè)，僅出現(xiàn)父本特異條帶的個(gè)體有1個(gè)(泳道22)，一共為61個(gè)。故試驗(yàn)中檢測(cè)的64個(gè)后代植株中有61個(gè)雙親雜交后代，雜交成功率為95.3%。

對(duì)于檢測(cè)出來的雜交成功的后代植株進(jìn)行了田間形態(tài)學(xué)性狀觀察，這些雜交后代在葉片特征、枝條顏色、果實(shí)性狀及風(fēng)味都帶有明顯的父本特征，表明父本基因型已經(jīng)進(jìn)入子代基因組中，也進(jìn)一步驗(yàn)證了分子鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 討論與結(jié)論

種間雜交是獲得植物新品種的重要途徑，通過種間雜交可以聚合雙親的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)雜種后代進(jìn)行早期鑒定與選擇是雜交育種中提高育種效率一個(gè)重要環(huán)節(jié)。實(shí)際應(yīng)用中大多數(shù)僅通過形態(tài)學(xué)觀察，辨別雜種后代是否雜交成功，但鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性并不高。SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記[13]，能夠區(qū)分雜合位點(diǎn)和純合位點(diǎn)，并且重復(fù)性及穩(wěn)定性好，試驗(yàn)操作簡單，已成功應(yīng)用于玉米[14]、水稻[15]、大豆[16]等植物的雜交種鑒定，目前在葡萄的染色體上已定位了753個(gè)SSR標(biāo)記[17]，為葡萄雜種純度的鑒定提供了理論依據(jù)。

本試驗(yàn)從15對(duì)引物中篩選出2對(duì)擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定、具有父母本特異性條帶的引物VrZAG83和VrZAG62，對(duì)刺葡萄雜交后代進(jìn)行了真實(shí)性鑒定，2對(duì)引物鑒定結(jié)果一致，共有61 個(gè)后代因具有父本特異性條帶而被鑒定為雙親雜交后代，

而其他3個(gè)后代可能是母本自交后代，或受外源花粉污染所致。另外為了更準(zhǔn)確地對(duì)刺葡萄雜交后代進(jìn)行鑒定，對(duì)雜交后代進(jìn)行田間形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果表明，鑒定出的雜交成功的后代在葉片、枝條、果實(shí)等方面都具有明顯的父本特征，而其他3個(gè)后代在形態(tài)特征上則與母本無顯著差異。

本試驗(yàn)中，田間形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果與分子鑒定結(jié)果基本一致，證明SSR標(biāo)記可以有效地對(duì)葡萄屬種間雜交后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，可用作葡萄屬種間種質(zhì)創(chuàng)新的有效輔助手段；綜合田間形態(tài)學(xué)觀察及SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定結(jié)果確定64個(gè)后代植株中有61個(gè)為真實(shí)雙親雜交后代，其結(jié)合了父母本的共有特征，本研究鑒定出的雜交成功的后代可以用于構(gòu)建葡萄的分子遺傳圖譜及對(duì)重要性狀進(jìn)行QTL定位，從而為刺葡萄的分子標(biāo)記輔助育種研究打下重要基礎(chǔ)。