王翠平， 陳建偉

(寧夏林業(yè)研究院種苗生物工程國家重點實驗室，寧夏銀川 750004

在環(huán)境脅迫如干旱、鹽、重金屬、紫外線等條件下，高等植物可以在短時間內(nèi)通過迅速大量地積累脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對自身起到保護(hù)作用，以此來增強植物對滲透脅迫的抵抗能力[1-5]。在脅迫條件下，脯氨酸可以作為兼容性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活性氧清除劑和氧化還原平衡劑[6-7]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸參與了開花及胚胎發(fā)育過程[8-11]。高等植物中，吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶[8-9]，而脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，PDH)是脯氨酸降解途徑的關(guān)鍵酶[10]。在擬南芥中，PDH定位于線粒體，由2個基因編碼(AtPDH1，At3g30775；AtPDH2，At5g30870)，脯氨酸處理會誘導(dǎo)PDH1表達(dá)，而脅迫處理抑制PDH1表達(dá)[11]。

植物進(jìn)化過程中多倍化是重要的進(jìn)化動力，并且許多作物經(jīng)歷了多倍化過程，多倍體能夠為新表型的出現(xiàn)提供原材料，具有進(jìn)化上的優(yōu)勢[12]。多倍化之后由于染色體重組和基因重排，有一些基因表達(dá)模式會發(fā)生變化，甚至?xí)l(fā)生丟失[13-14]。蕓薹屬(Brassica)植物是研究由于多倍化引起的基因缺失、沉默和偏向表達(dá)的非常好的模式植物體系，禹氏三角模型能夠很好地解釋蕓薹屬植物的進(jìn)化關(guān)系[15]。甘藍(lán)型油菜(Bassicanapus)是最新形成的異源四倍體，來源于2個二倍體白菜(B.rapa)和甘藍(lán)(B.oleracea)種間雜交，并且經(jīng)歷了染色體加倍的過程[16]。而白菜、甘藍(lán)和擬南芥起源于共同的祖先，大概在1 450萬～2 040萬年之前這個祖先分化為擬南芥和白菜、甘藍(lán)的祖先[17]。比較物理圖譜結(jié)果表明，白菜和甘藍(lán)的祖先經(jīng)歷了三倍化和基因重排的過程[18]。且白菜基因組測序數(shù)據(jù)也表明，白菜中大多數(shù)基因具有2～3個同源基因[19]。那么，推測異源四倍體油菜中同源基因拷貝數(shù)應(yīng)該更多。有報道稱，油菜中基因拷貝數(shù)目可能由于進(jìn)化過程中基因丟失的原因而減少[20]。

脅迫條件下脯氨酸積累是一個非常保守且有效的過程，然而迄今為止仍不清楚四倍體中脯氨酸代謝相關(guān)基因的進(jìn)化模式及其與二倍體祖先脯氨酸代謝相關(guān)基因的關(guān)系。之前研究發(fā)現(xiàn)，油菜中含有6個脯氨酸合成途徑關(guān)鍵基因P5CS1，即該基因沒有發(fā)生丟失，并且在不同器官中與脅迫誘導(dǎo)情況下不同來源的P5CS1基因表達(dá)模式不同[21]。本研究集中探討了甘藍(lán)型油菜中脯氨酸降解代謝相關(guān)基因PDH1和PDH2的進(jìn)化命運，包括二倍體親本進(jìn)化上的來源、與二倍體親本物種的基因序列差異和重復(fù)基因是否發(fā)生丟失。研究結(jié)果能夠加深多倍化對脯氨酸代謝相關(guān)基因影響的理解，為多倍體表型和重復(fù)基因調(diào)控的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 基因序列分析

白菜和甘藍(lán)的相應(yīng)基因序列由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所王曉武研究員提供，并且通過數(shù)據(jù)庫檢索和比對(http：//www.brassica.info/； http：//www.ocri-genomics.org/bolbase/index.html)。油菜基因序列來自于開放的油菜基因組序列網(wǎng)站(http：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)。核酸序列分析應(yīng)用DNAMAN軟件(Lynnon Biosoft，Vaudreuil，Quebec，Canada)。通過對同源基因?qū)?yīng)位置的部分基因組DNA進(jìn)行比對和序列分析，應(yīng)用MEGA4軟件中鄰位相連法構(gòu)建進(jìn)化樹[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜中脯氨酸合成代謝相關(guān)重復(fù)基因

2.1.1 白菜、甘藍(lán)、油菜中的PDH1基因概況 序列分析結(jié)果表明，白菜中存在3個PDH1的同源基因(http：//www.brassica.info/)(ChrA2，Bra020731；ChrA6，Bra025421；ChrA9，Bra036196)，甘藍(lán)中存在3個PDH1基因(http：//www.ocri-genomics.org/bolbase/index.html)(Bol033129；Bol043056；Bol032297)，甘藍(lán)型油菜中存在5個PDH1基因(http：//www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/) (ChrC7，NC_027773.1；ChrC5，NC_027771.1；ChrC5，NC_027771.1；ChrA9，NC_027765.1；unplaced genomic scaffold，NW_013650408.1)。根據(jù)系統(tǒng)命名法則[23]，將白菜的3個PDH1同源基因分別命名為BraA.PDH1.a、BraA.PDH1.b、BraA.PDH1.c；將甘藍(lán)的3個PDH1基因分別命名為BolC.PDH1.a、BolC.PDH1.b、BolC.PDH1.c；將甘藍(lán)型油菜的5個PDH1基因分別命名為BnaA.PDH1.a、BnaA.PDH1.b、BnaC.PDH1.c、BnaC.PDH1.d、BnaC.PDH1.e。與擬南芥相同，蕓薹屬植物的PDH1基因也具有4個外顯子和3個內(nèi)含子，除第1外顯子比擬南芥第1外顯子少3個堿基以外，其他外顯子堿基數(shù)目一致(表1)。蕓薹屬植物白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的基因組序列(從ATG到終止密碼子)長度為2 201～2 671 bp，然而編碼區(qū)(CDS)長度一致，均為1 497 bp，所編碼的蛋白質(zhì)都含有498個氨基酸。

表1 蕓薹屬PDH1基因結(jié)構(gòu)對比

2.1.2 白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中PDH2基因概況 基因組測序結(jié)果表明，白菜中存在1個PDH2基因(Bra028202)，位于白菜A4號染色體上，命名為BraA.PDH2.a；甘藍(lán)中存在1個PDH2基因，命名為BolC.PDH2.a；甘藍(lán)型油菜中存在2個PDH2基因，分別命名為BnaA.PDH2.a、BnaC.PDH2.b。蕓薹屬植物PDH2基因cDNA編碼區(qū)長度為1 431 bp，含有4個外顯子3個內(nèi)含子，和擬南芥一致(表2)。

表2 蕓薹屬PDH2基因結(jié)構(gòu)對比

2.2 脯氨酸合成酶基因的同源性和進(jìn)化關(guān)系

2.2.1PDH1基因的同源性和進(jìn)化關(guān)系 為研究甘藍(lán)型油菜中的5個PDH1基因的二倍體祖先在甘藍(lán)型油菜染色體加倍過程中來自于白菜基因組還是甘藍(lán)基因組，將5個基因分別與白菜及甘藍(lán)的PDH1基因的基因組序列及編碼區(qū)序列做兩兩序列比對，結(jié)果如表2所示。同時，將甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥的同源PDH1基因的基因組DNA序列作多重比對，構(gòu)建該基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖1)。

序列相似性分析結(jié)果(表3)表明，BnaA.PDH1.a和BraA.PDH1.a、BnaA.PDH1.b和BraA.PDH1.c、BnaC.PDH1.c和BolC.PDH1.a、BnaC.PDH1.d和BolC.PDH1.b、BnaC.PDH1.e和BolC.PDH1.c之間的基因組DNA相似性分別為96.34%、99.67%、99.78%、98.48%、91.62%，而它們之間編碼區(qū)相似性更高，分別為99.20%、99.67%、99.80%、99.20%、99.53%，無論是基因組序列還是編碼區(qū)序列均高于同系列其他比對。因此，推斷BnaA.PDH1.a、BnaA.PDH1.b、BnaC.PDH1.c、BnaC.PDH1.d和BnaC.PDH1.e可能分別來

源于BraA.PDH1.a、BraA.PDH1.c、BolC.PDH1.a、BolC.PDH1.b和BolC.PDH1.c。而白菜的BraA.PDH1.b在甘藍(lán)型油菜中發(fā)生丟失。

而基于相對應(yīng)的基因組序列的進(jìn)化關(guān)系分析表明，BnaA.PDH1.a、BnaA.PDH1.b、BnaC.PDH1.c、BnaC.PDH1.d、BnaC.PDH1.e分別為白菜BraA.PDH1.a、BraA.PDH1.c和甘藍(lán)BolC.PDH1.a、BolC.PDH1.b、BolC.PDH1.c的直向同源基因(圖1)。

表3 甘藍(lán)型油菜PDH1基因的基因組序列和編碼區(qū)序列與二倍體親本白菜和甘藍(lán)PDH1基因序列相似性分析

2.2.2PDH2基因的同源性和進(jìn)化關(guān)系 甘藍(lán)型油菜基因組中含有2個同源的PDH2基因，為了研究這2個基因的祖先來源，將2個基因分別與白菜及甘藍(lán)的PDH2基因基于基因組序列和編碼區(qū)序列做兩兩序列比對，比對結(jié)果如表4所示。同時，將甘藍(lán)型油菜、白菜、甘藍(lán)和擬南芥的所有已知序列的同源PDH2基因的基因組DNA序列作多重比對，構(gòu)建該基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)。

序列相似性分析結(jié)果表明，BnaA.PDH2.a與BraA.PDH2.a、BnaC.PDH2.b與BolC.PDH2.a基因組DNA序列相似性分別高達(dá)96.73%、99.67%(表4)，而它們之間編碼區(qū)相似性更高，分別為99.86%、99.93%(表4)，無論是基因組序列還是編碼區(qū)序列均高于同系列其他比對，推測BnaA.PDH2.a、BnaC.PDH2.b可能分別來源于BraA.PDH2.a、BolC.PDH2.a。

且基于相對應(yīng)的基因組序列的進(jìn)化關(guān)系分析也表明，BnaA.PDH2.a、BnaC.PDH2.b分別為白菜BraA.PDH2.a、甘藍(lán)BolC.PDH2.a的直向同源基因(圖2)。

表4 甘藍(lán)型油菜中PDH2基因的基因組片段與二倍體祖先中相對應(yīng)的基因核苷酸序列相似性

3 討論

3.1 油菜的PDH1基因可能發(fā)生了1個拷貝的丟失

甘藍(lán)型油菜(B.napus)起源于白菜(B.rapa)和甘藍(lán)(B.oleracea)的雜交，并且經(jīng)過了染色體加倍，而其祖先白菜和甘藍(lán)自身也經(jīng)歷了基因組三倍化和重排的過程[16]，這樣推測甘藍(lán)型油菜中每個基因同源基因的拷貝數(shù)最多可以達(dá)到6個。然而研究發(fā)現(xiàn)，由于基因丟失現(xiàn)象的存在，甘藍(lán)型油菜中同源基因的拷貝數(shù)平均為4個[20]。研究表明，甘藍(lán)型油菜中存在3個ALCATRAZ(ALC)基因[24]、3個GPAT4(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 4)基因，然而存在的6個PSY(Phytoene Synthase)基因中有3個來源于白菜，另外3個來源于甘藍(lán)[25]，而筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，甘藍(lán)型油菜中存在6個P5CS1基因[21]。本研究中，甘藍(lán)型油菜中存在5個PDH1基因，而其祖先白菜和甘藍(lán)中各存在3個PDH1基因，進(jìn)化過程中甘藍(lán)型油菜可能發(fā)生了PDH1基因1個拷貝的丟失，而根據(jù)序列比對和進(jìn)化分析結(jié)果，推測來自于二倍體祖先白菜的PDH1基因的1個拷貝發(fā)生丟失。而甘藍(lán)型油菜中存在2個PDH2基因，其祖先白菜和甘藍(lán)中各存在1個PDH2基因，甘藍(lán)型油菜中PDH2基因沒有發(fā)生丟失。

3.2 油菜中脯氨酸代謝相關(guān)基因與二倍體親本來源基因高度同源

根據(jù)白菜和甘藍(lán)全基因組測序結(jié)果，白菜和甘藍(lán)中PDH1和PDH2同源基因拷貝數(shù)都分別為3、1，而甘藍(lán)型油菜中拷貝數(shù)為5、2。序列比對結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜脯氨酸代謝途徑相關(guān)基因均與其親本白菜和甘藍(lán)來源的基因高度同源，PDH1和PDH2同源基因和親本來源基因的基因組DNA同源性分別為91.62%～99.78%、96.73%～99.67%。說明這些基因在甘藍(lán)型油菜進(jìn)化過程中高度保守。這與之前的甘藍(lán)型油菜基因克隆的相關(guān)研究報道一致，甘藍(lán)型油菜中克隆得到3個PISTILLATA基因，兩兩序列相似性為96.49%～98.72%[26]。脯氨酸合成途徑上不同基因拷貝數(shù)的不同或許說明了這些基因在進(jìn)化上的重要程度。

4 結(jié)論

以甘藍(lán)型油菜、白菜和甘藍(lán)為試驗材料，研究了甘藍(lán)型油菜中脯氨酸代謝途徑同源基因的進(jìn)化命運，探討了多倍化對同源基因進(jìn)化的影響。主要結(jié)論如下：通過白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜的基因組數(shù)據(jù)庫搜索和序列比對，確定了脯氨酸降解途徑關(guān)鍵基因(PDH1、PDH2)在甘藍(lán)型油菜中均存在多個拷貝，序列比對結(jié)果表明，它們和二倍體親本白菜及甘藍(lán)的對應(yīng)基因高度同源；和親本相比，甘藍(lán)型油菜的PDH1基因來自于二倍體祖先甘藍(lán)的1個拷貝發(fā)生了丟失，而PDH2基因沒有發(fā)生丟失。