辛松林，向澤攀，亢小勤，肖 川，秦 文*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川旅游學(xué)院 食品學(xué)院，四川 成都 610100)

秋葵又名補(bǔ)腎草、羊角豆，屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物[1]，現(xiàn)多作為功能性蔬菜食用[2]。秋葵采后非常容易老化，在室溫下僅能貯藏2～3 d，如果不能及時(shí)銷售或加工，果實(shí)會(huì)由原來的細(xì)嫩、多汁變?yōu)橘|(zhì)地生硬、粗糙、少汁，嚴(yán)重影響秋葵的商品性。木質(zhì)素是由肉桂醇等單體通過聚合生成的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的酚類多聚體[3]，是植物細(xì)胞壁在次生加厚過程中形成的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)[4]，在維持細(xì)胞壁的物理特征、疏水性、輸導(dǎo)性能和機(jī)械強(qiáng)度方面起著基礎(chǔ)作用[5]，而且在抵御病菌微生物侵害方面也具有非常重要的作用[6]。目前，已對枇杷[7]、琯溪蜜柚[8]、草莓[9]、枸杞[10]等開展了果實(shí)采前木質(zhì)素在逆境抗性方面的研究，對南豐蜜橘[11]、碭山酥梨[12]、黑果枸杞[13]等開展了果實(shí)采后木質(zhì)素在逆境抗性方面的研究，但關(guān)于秋葵果實(shí)木質(zhì)素代謝的研究鮮有報(bào)道。秋葵果莢采摘前的木質(zhì)素代謝程度會(huì)影響其采摘后在貯藏過程中的衰老進(jìn)程[14]。本試驗(yàn)以川秋葵為材料，對采摘前秋葵果實(shí)木質(zhì)素代謝、細(xì)胞壁成分，以及部分相關(guān)酶活性進(jìn)行測定和分析，深入了解秋葵果實(shí)生長、成熟及老化過程中木質(zhì)素代謝的特征和規(guī)律，闡明采摘期對秋葵果實(shí)木質(zhì)素代謝及相關(guān)成分的影響，旨在為確定較合理的果實(shí)采收時(shí)間提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2006—2015年，四川省植物工程研究院引種非洲黃秋葵成功，并從中選育出適合四川省栽培的黃秋葵新品種——川秋葵1號(hào)。本試驗(yàn)所用秋葵品種為四川省植物工程研究院提供的川秋葵1號(hào)。結(jié)果盛期，每天上午8:00從田間采收不同長度的果實(shí)，通過前期的觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以花自然掉落當(dāng)天為0 d(即盛花期后0 d)，在13 d果實(shí)完全老化、木質(zhì)化，喪失商品價(jià)值無法食用，據(jù)此，將采收期分為8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采收30個(gè)果實(shí)(表1、圖1)。

試驗(yàn)所用主要儀器有UV-3200掃描型紫外/可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)、冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo公司)、恒溫水浴鍋、電子天平、培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 木質(zhì)素形成相關(guān)酶的測定

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)活性測定參照Liu等[15]的方法，于290 nm處測定吸光度，酶活性以1 g樣品1 h吸光度變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U·g-1，以樣品鮮質(zhì)量計(jì))；肉桂酸-4羥化酶(cinaamate 4-hydroxylase，C4H)測定參照Lamb等[16]的方法，于340 nm處測定吸光度，酶活性以1 g樣品1 min吸光度變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U·g-1，以樣品鮮質(zhì)量計(jì))；4-香豆酰-輔酶A連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)活性測定參照朱明華等[17]的方法，于333 nm處測定吸光度，酶活以1 g樣品1 min吸光度變化0.1為1個(gè)酶活性單位(U·g-1，以樣品鮮質(zhì)量計(jì))；肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)活性測定參照Morrison等[18]的方法，于340 nm處測定吸光度，酶活性以1 h吸光度變化0.01為1個(gè)活性單位，計(jì)算酶比活性(U·mg-1，以蛋白質(zhì)含量計(jì))；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測定參照J(rèn)iang等[19]的方法，酶活性以1 g樣品1 min在470 nm處吸光度變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U·g-1，以樣品鮮質(zhì)量計(jì))；多酚氧化酶(polyphenoloxidase，PPO)活性測定參照Galeazzi[20]的方法，以1 g樣品1 min在420 nm處吸光度增加0.01為1個(gè)酶活性單位(U·g-1，以樣品鮮質(zhì)量計(jì))。

表1秋葵果實(shí)采摘時(shí)間

Table1Picking time for okra fruit

編號(hào)No.采摘時(shí)間Picking time/d果實(shí)長度Fruit length/cmA0～11.0～2.0B2～32.0～4.0C4～54.0～6.0D6～76.0～9.0E8～99.0～12.0F10～1110.0～15.0G12～1310.0～15.0H>13>10.0

盛花后長出果實(shí)計(jì)為0 d，此時(shí)果實(shí)長度為1.0～1.5 cm。

Marked 0 d as the pod appear after bloomed， the length was 1.0-1.5 cm at this time.

圖1 不同采摘時(shí)間秋葵果實(shí)形態(tài)Fig.1 Appearance of okra pod picked at different time

1.2.2 秋葵果肉組織成分的測定

水溶性果膠和原果膠的測定參照曹建康等[21]的方法，用半乳糖醛酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算果肉組織中水溶性果膠和原果膠含量，以產(chǎn)生半乳糖醛酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)表示；纖維素相對含量的測定參照袁莉[22]的方法，纖維素相對含量以單位樣品(g)的D620值變化表示；木質(zhì)素相對含量的測定參照Morrison[23]的方法，木質(zhì)素相對含量以單位樣品(g)的D280值變化表示；總酚和類黃酮相對含量的測定參照曹建康等[21]的方法，總酚相對含量用單位樣品(g)的D280值變化表示，類黃酮相對含量用單位樣品(g)的D325值變化表示。以上物質(zhì)含量均以樣品鮮質(zhì)量計(jì)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品平行測定5次，數(shù)據(jù)釆用Microsoft office excel和SPSS 22.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶活性

隨著秋葵花后生長時(shí)間的延長，PAL最低活性出現(xiàn)在花后8～9 d，如圖2-A所示，此時(shí)果實(shí)長度為9.0～12.0 cm，活性為112.7 U·g-1；PAL最高活性出現(xiàn)在盛花期后12～13 d，此時(shí)果實(shí)長度為10.0～15.0 cm，活性為559.05 U·g-1。PPO能夠在酚類物質(zhì)氧化過程中發(fā)揮作用，有助于木質(zhì)素前體物質(zhì)的形成。如圖2-B所示，花后0～13 d，PPO酶活性呈現(xiàn)波動(dòng)性變化，為0.12～0.72 U·g-1，并總體呈下降趨勢，在花后0～1 d活性最高。POD是催化木質(zhì)素單體合成木質(zhì)素的重要酶類，影響組織的木質(zhì)化。如圖2-C所示，秋葵果實(shí)POD活性在花后0～5 d緩慢升高，并在花后4～5 d達(dá)到最高值，隨后在6～7 d出現(xiàn)顯著下降，并在8～9 d時(shí)出現(xiàn)再次升高，之后緩慢降低。

丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、4-香豆酰-輔酶A連接酶、肉桂酸-4羥化酶活性以鮮質(zhì)量計(jì)；肉桂醇脫氫酶活性以蛋白含量計(jì)。Activities of PAL、PPO、POD、4CL、C4H were detected based on fresh weight. Activity of CAD was detected based on protein content.圖2 不同采摘時(shí)間對秋葵苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶、4-香豆酰-輔酶A連接酶、肉桂酸-4羥化酶、肉桂醇脫氫酶活性的影響Fig.2 Effects of picking time on the activities of PAL、PPO、POD、4CL、C4H、CAD in okra pod

秋葵果實(shí)4CL活性呈波動(dòng)性變化趨勢，在花后4～5 d 時(shí)達(dá)到最大值，為66.3 U·g-1，如圖2-D所示，隨著秋葵的成熟衰老，其4CL活性呈波浪式上升，盛花期后10～11 d時(shí)達(dá)到第2個(gè)高峰值，為55.7 U·g-1。如圖2-E所示，秋葵果實(shí)C4H的活性呈現(xiàn)下降趨勢，即隨著秋葵果實(shí)長度的增加，C4H活性逐漸降低，C4H活性最高值為236.7 U·g-1，最低值為54.8 U·g-1，差異極顯著(P<0.01)。如圖2-F所示，隨著秋葵在盛花期后時(shí)間的延長，CAD活性呈上升趨勢，盛花期后12～13 d CAD活性最高，為22.8 U·mg-1，比CAD活性最低時(shí)高244%。

2.2 采摘時(shí)間與秋葵果實(shí)木質(zhì)化相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系

2.2.1 采摘時(shí)間對秋葵木質(zhì)素、纖維素相對含量的影響

隨著采摘時(shí)間推遲，秋葵果實(shí)中木質(zhì)素相對含量呈上升趨勢，含量大幅度提高出現(xiàn)在花后3～5 d，如圖3-A所示。木質(zhì)素相對含量在8～9 d下降，之后又上升，在花后12～13 d達(dá)到高峰0.97 g-1。

纖維素和木質(zhì)素變化趨勢相似。如圖3-B所示，隨著秋葵生長期的延長及果實(shí)長度的增加，秋葵果實(shí)中纖維素相對含量不斷增加，盛花期后3～5 d纖維素相對含量增加迅速，由0.25 g-1上升到0.60 g-1，增加了140%。

2.2.2 果實(shí)采摘時(shí)間與果實(shí)類黃酮、總酚相對含量的關(guān)系

酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)是木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)，與木質(zhì)素的合成密切相關(guān)。如圖4所示，秋葵果實(shí)的總酚和類黃酮相對含量均呈先上升后下降的趨勢，類黃酮相對含量在花后4～5 d達(dá)到峰值3.44 g-1，總酚相對含量在花后2～3 d達(dá)到峰值2.24 g-1，隨后緩慢下降。

數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。下同。Data were detected based on fresh weight. The same as bellow.圖3 果實(shí)采摘時(shí)間對秋葵木質(zhì)素、纖維素相對含量的影響Fig.3 Effects of picking time on relative contents of lignin and cellulose in okra pod

圖4 果實(shí)采摘時(shí)間對秋葵類黃酮、總酚相對含量的影響Fig.4 Effects of picking time on relative contents of total phenolic and flavonoid in okra pod

2.2.3 果實(shí)采摘時(shí)間對原果膠、水溶性果膠含量的影響

隨著采摘時(shí)間的增加，秋葵原果膠含量呈先上升后下降趨勢(圖5-A)，水溶性果膠在整個(gè)采摘期均呈現(xiàn)上升趨勢，并在花后10～11 d顯著升高(圖5-B)。

圖5 果實(shí)采摘時(shí)間對秋葵原果膠、水溶性果膠含量的影響Fig.5 Effects of picking time on contents of protopectin and water soluble pectin in okra pod

3 結(jié)論與討論

在秋葵果實(shí)發(fā)育過程中，木質(zhì)素、纖維素相對含量大幅度提高出現(xiàn)在花后2～5 d，即果實(shí)長度2.0～6.0 cm，之后木質(zhì)素相對含量上升緩慢；PAL和C4H活性在花后5 d之后顯著下降，6～7 d比4～5 d分別降低53.4%和57.0%，4CL活性、POD活性、原果膠含量、類黃酮相對含量在花后4～5 d達(dá)到最大值。此外，PAL、C4H、4CL這3個(gè)關(guān)鍵酶在不同采收時(shí)間呈現(xiàn)較明顯的對應(yīng)變化關(guān)系，但出現(xiàn)峰值或谷值并不在同一時(shí)間點(diǎn)，這可能與秋葵木質(zhì)素合成的前體物質(zhì)或非酶類反應(yīng)有關(guān)。從川秋葵果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值、保健功能和食用品質(zhì)角度考慮，認(rèn)為川秋葵果實(shí)最佳采收時(shí)間為花后4～5 d(果實(shí)長度為4.0～6.0 cm)。

3.1 木質(zhì)素合成途徑酶的變化

木質(zhì)素單體經(jīng)過苯丙烷途徑合成，PAL是苯丙烷代謝途徑中催化第一步反應(yīng)的酶，是木質(zhì)素合成的限速酶[24-25]，能催化和調(diào)控酚類、類黃酮等抗菌物質(zhì)的合成；C4H是催化苯丙烷代謝途徑第二步反應(yīng)的酶，PAL酶促作用的產(chǎn)物肉桂酸是C4H的作用底物，而肉桂酸含量增加可誘導(dǎo)C4H活性增強(qiáng)[26-27]；4CL是苯丙烷代謝途徑中的最后一個(gè)酶，經(jīng)過一系列反應(yīng)最終生成酚類、木質(zhì)素等物質(zhì)[28]；不同植物的4CL功能不盡相同，通常認(rèn)為在木質(zhì)素單體合成途徑中4CL為限速步驟[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，采摘期內(nèi)PAL活性在花后6～9 d降到較低水平，之后顯著升高，C4H呈現(xiàn)下降趨勢，4CL呈現(xiàn)M型波動(dòng)變化，其峰值出現(xiàn)在花后4～5 d，而這一時(shí)間段也是木質(zhì)素和纖維素含量迅速升高的階段，因此，可以推斷花后4～5 d是秋葵品質(zhì)形成重要時(shí)期。POD和PPO是苯丙烷代謝途徑末端反應(yīng)的相關(guān)酶，參與細(xì)胞壁的生長和交聯(lián)化反應(yīng)[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在木質(zhì)素含量上升時(shí)，秋葵果實(shí)中POD和PPO活性卻呈波動(dòng)式下降趨勢，間接表明秋葵木質(zhì)素單體的聚合可能是一個(gè)非酶促的過程[31]。

3.2 采摘期與秋葵果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)關(guān)系

果實(shí)質(zhì)地主要取決于果膠、纖維素、木質(zhì)素等細(xì)胞壁物質(zhì)的質(zhì)和量，它是果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，又與果實(shí)的成熟衰老密切相關(guān)[7]。果膠物質(zhì)有黏結(jié)細(xì)胞個(gè)體的作用，木質(zhì)素可通過形成交織網(wǎng)使細(xì)胞相連，強(qiáng)化細(xì)胞壁，纖維素有支持細(xì)胞骨架和保護(hù)的作用[32]。纖維素和木質(zhì)素含量隨果莢長度的增加而增加，木質(zhì)素和纖維素含量的變化直接影響果實(shí)的質(zhì)地，其含量越高質(zhì)地越老，口感粗糙，從而降低可食性[33]。未成熟的秋葵果實(shí)中果膠物質(zhì)與纖維素結(jié)合以原果膠形式存在，秋葵果實(shí)原果膠含量較高，使得果實(shí)堅(jiān)實(shí)、脆硬。隨著秋葵果實(shí)的成熟，果膠物質(zhì)逐漸與纖維素分離形成水溶性果膠，因此，果實(shí)長度較長的秋葵水溶性果膠含量較高。

3.3 采摘期與秋葵功能性成分變化關(guān)系

酚類、黃酮類作為功能性成分，其含量決定了植物營養(yǎng)及保健功能。此外，酚類、黃酮類物質(zhì)作為苯丙烷類代謝途徑的次級(jí)代謝產(chǎn)物[34]，在植物的生長發(fā)育、抵御病蟲害、抗逆反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[35]。秋葵總酚含量在花后4～5 d達(dá)到峰值，而類黃酮含量則在花后2～3 d達(dá)到峰值。徐康[36]以“綠箭”為材料，發(fā)現(xiàn)秋葵果實(shí)總酚及黃酮含量在花后0～11 d逐漸升高，之后快速降低。本研究結(jié)果與此不一致，推測是不同品種植物的功能性成分變化有差異造成的。