戴寶玲，楊 華，戴賢君楊桂玲，汪 雯，肖英平，*

(1.中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)又叫樹梅、朱紅，在植物學(xué)上屬于楊梅科楊梅屬果樹[1]，具有悠久的栽培歷史，普遍生長(zhǎng)于我國(guó)南方，我國(guó)楊梅栽培面積約占世界的99%[2]。楊梅果實(shí)一般在5—6月成熟，其色澤鮮艷，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，且有生津止渴、健脾開胃之功效，是集觀賞、食用、藥用于一身的果種，深受消費(fèi)者喜愛[3]。但由于楊梅果實(shí)在初夏高溫、高濕的梅雨季節(jié)成熟及收獲，裸露的肉柱柔軟多汁，表皮極薄[4]，無組織保護(hù)，易受病蟲害和微生物污染。

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)是一種革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，不僅是醫(yī)院感染中常見的重要致病菌，而且是導(dǎo)致社區(qū)獲得性感染的重要病原[5-7]。肺炎克雷伯氏菌常寄生在人類呼吸道、皮膚和腸道中，可引起人類壞死性肺炎、細(xì)菌性肝膿瘍、尿道感染和菌血癥等感染[8]。近年來，肺炎克雷伯氏菌感染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，耐藥性較強(qiáng)，且為多重耐藥，給治療帶來了很大的困難[9]。目前，對(duì)肺炎克雷伯氏菌的研究主要是在醫(yī)院環(huán)境和臨床病人方面[10]，而在食物，尤其是鮮食果蔬污染方面的研究較少。本研究針對(duì)楊梅這一經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的鮮食水果，分析其肺炎克雷伯氏菌的攜帶狀況，并進(jìn)一步闡明其攜帶的肺炎克雷伯氏菌耐藥特性和毒力基因，為楊梅和其他鮮食果蔬的病原菌污染研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

分別從杭州市場(chǎng)和華東地區(qū)楊梅生產(chǎn)基地采集90份樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基與儀器

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose，LST)肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基等均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏分析儀，法國(guó)生物梅里埃公司；PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司。

1.2 肺炎克雷伯氏菌的分離

參照GB4789.3—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》先測(cè)定楊梅中的大腸菌群含量，再利用LST產(chǎn)氣篩選腸桿菌科細(xì)菌接種于麥康凱培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑可疑菌落接種在LB培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后用于鑒定保存。實(shí)驗(yàn)操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.3 肺炎克雷伯氏菌的鑒定與進(jìn)化關(guān)系

用棉簽蘸取LB培養(yǎng)基上的單菌落配制成0.50～0.63麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，使用VITEK 2 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡(GN卡，貨號(hào)：21341)在梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀上鑒定。采用引物P1: F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG和P2: R-GGTTACCTTGTTACGACTT[11]對(duì)其16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲得的序列在GenBank中與相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[12]。

1.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

取145 μL的0.50麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙河谘b有3 mL蒸餾水的小管中，使用VITEK 2 革蘭氏陰性藥敏卡(AST-GN16卡，貨號(hào)：22139)在生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀上檢測(cè)。

1.5 肺炎克雷伯菌耐藥基因和毒力基因的擴(kuò)增

以提取的楊梅表面肺炎克雷伯氏菌細(xì)菌DNA為模板，按照參考文獻(xiàn)[13-25]合成特異性引物，PCR檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的耐藥基因(表1)和毒力基因(表2)，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

表1肺炎克雷伯氏菌耐藥基因列表

Table1Drug resistance genes ofKlebsiellapneumoniae

基因Genes引物Primer引物序列Sequence(5′→3′)片段長(zhǎng)度Amplicon size/bp退火溫度Annealing tempreture/℃參考文獻(xiàn)ReferenceblaTEMblaTEM-FCCCCGAAGAACGTTTTC51751[13]blaTEM-RATCAGCAATAAACCAGCblaCTX-MblaCTX-M-FCGATGTGCAGTACCAGTAA58560[13]blaCTX-M-RTTAGTGACCAGAATAAGCGGgyrAgyrA-FACGTACTAGGCAATGACTGG18958[14]gyrA-RAGAAGTCGCCGTCGATAGAAtetAtetA-FGCTACATCCTGCTTGCCTTC21060[15]tetA-RCATAGATCGCCGTGAAGAGGfloRfloR-FAACCCGCCCTCTGGATCAAGTCAA54858[16]floR-RCAAATCACGGGCCACGCTGTATCereAereA-FAACACCCTGAACCCAAGGGACG42058[17]ereA-RCTTCACATCCGGATTCGCTCGAermBermB-FGAAAAGGTACTCAACCAAATA63952[18]ermB-RAGTAACGGTACTTAAATTGTTTACmecAmecA-FAAAATCGATGGTAAAGGTTGGC53360[19]mecA-RAGTTCTGCAGTACCGGATTTGCaadA1aadA1-FTATCCAGCTAAGCGCGAAC44758[20]aadA1-RATTTGCCGACTACCTTGGTaac(6′)-1baac(6′)-1b-FATGACTGAGCATGACCTTGC51955[21]aac(6′)-1b-RTTAGGCATCACTGCGTGTTC

表2肺炎克雷伯氏菌毒力基因列表

Table2Virulence genes ofKlebsiellapneumoniae

基因Genes引物Primer引物序列Sequence(5′→3′)片段長(zhǎng)度Amplicon size/bp退火溫度Annealing tempreture/℃參考文獻(xiàn)ReferencewcaGwcaG-FGGTTGGKTCAGCAATCGTA16953[22]wcaG-RACTATTCCGCCAACTTTTGCmagAmagA-FGGTGCTCTTTACATCATTGC1 28253[23]magA-RGCAATGGCCATTTGCGTTAGrmpArmpA-FACTGGGCTACCTCTGCTTCA53550[24]rmpA-RCTTGCATGAGCCATCTTTCA菌素AerobactinAerobactin-FGCATAGGCGGATACGAACAT55655[25]Aerobactin-RCACAGGGCAATTGCTTACCT

2 結(jié)果與分析

2.1 肺炎克雷伯氏菌的鑒定

在90份樣品中，共有51份樣品在LST肉湯管產(chǎn)氣，楊梅中大腸菌群的污染率為56.7%。在大腸菌群污染的楊梅中，大腸菌群含量為0.1～4.2 cfu·g-1。經(jīng)過VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定出9株肺炎克雷伯菌。16S rRNA序列鑒定結(jié)果表明，該9株菌均為肺炎克雷伯氏菌。因此，肺炎克雷伯氏菌在楊梅中的檢出率為10%。

2.2 肺炎克雷伯氏菌的進(jìn)化關(guān)系

采用16S rRNA序列進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，在所獲得的9株肺炎克雷伯氏菌中，8株肺炎克雷伯氏菌聚為一簇，親緣關(guān)系較近，而菌株編號(hào)為CX-8的肺炎克雷伯氏菌同其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

2.3 藥敏實(shí)驗(yàn)

分別研究了肺炎克雷伯氏菌對(duì)18種抗生素的耐藥性，結(jié)果表明：9株肺炎克雷伯氏菌對(duì)氨芐西林耐藥率最高，為88.89%，對(duì)頭孢唑林和呋喃咀啶的耐藥率分別為22.22%和11.11%，而對(duì)檢測(cè)的其他15種抗生素均為100%敏感(表3)。其中，1株肺炎克雷伯氏菌對(duì)所測(cè)定的所有抗生素敏感，1株菌同時(shí)耐氨芐西林、頭孢唑林和呋喃咀啶3種抗生素。

圖1 九株肺炎克雷伯氏菌的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 9 strains of Klebsiella pneumoniae

表3九株肺炎克雷伯氏菌對(duì)18種抗菌藥物的耐藥性

Table3Drug resistance of 9Klebsiellapneumoniaeto 18 kinds of antibiotics

抗生素Antibiotics耐藥菌株數(shù)量No. of drug-resistant strain耐藥率Drug resistancerate/%氨芐西林Ampicillin888.89阿莫西林Amoxicillin00哌拉西林Pineracillin00頭孢唑林Cefazolin222.22頭孢西丁Cefoxitin00頭孢曲松鈉Ceftriaxone00頭孢吡肟Cefepime00氨曲南Aztreonam00厄他培南Ertapenem00亞胺培南Imipenem00阿米卡星Amikacin00慶大霉素Gentamicin00妥布霉素Tobramycin00環(huán)丙沙星Ciprofloxacin00左氧氟沙星Levofloxacin00替加環(huán)素Tigecycline00呋喃咀啶Nitrofurantoin111.11甲氧芐啶Trimethoprim00

2.4 耐藥基因和毒力基因的檢出情況

圖2 耐藥基因的攜帶情況Fig.2 Carrying of resistance gene

為了解分離到的肺炎克雷伯氏菌攜帶耐藥基因和毒力基因情況，分別檢測(cè)了10個(gè)耐藥基因和4個(gè)毒力基因。結(jié)果表明：9株肺炎克雷伯氏菌中均檢出四環(huán)素類藥物獲得性耐藥基因tetA，攜帶率100%；8株肺炎克雷伯氏菌株同時(shí)檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類藥物獲得性耐藥基因blaTEM、喹諾酮類耐藥基因gyrA、四環(huán)素類耐藥基因tetA和氨基糖苷類藥物獲得性耐藥基因aadA1與aac(6′)-1b(圖2)。耐藥基因blaCTX-M、floR、ereA、ermB和mecA未檢出。毒力基因wcaG、magA、rmpA和菌素在這9株菌中均未檢出。

3 結(jié)論與討論

分別從杭州市場(chǎng)和華東地區(qū)楊梅生產(chǎn)基地采集楊梅進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌的分離，90份楊梅樣品中共檢出9株肺炎克雷伯氏菌，檢出率為10%，這9株肺炎克雷伯氏菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑林和呋喃咀啶的耐藥率分別是88.89%、22.22%和11.11%，耐藥基因tetA的檢出率為100%，blaTEM、gyrA、aadA1和aac(6′)-1b耐藥基因的檢出率均為88.89%，而毒力基因wcaG、magA、rmpA和菌素均未檢出。

新鮮農(nóng)產(chǎn)品全年都有供應(yīng)，深受人們喜愛，消費(fèi)量也大幅度增加[26]。然而新鮮水果通常存在單增李斯特氏菌、大腸桿菌和沙門氏菌等重要病原體，在其成熟后采摘與加工過程中，可能會(huì)發(fā)生致病菌的污染[27-28]。楊梅柔軟多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，難免會(huì)發(fā)生在生產(chǎn)過程中受環(huán)境微生物的自然污染、徒手采摘及包裝時(shí)交叉污染、加工條件差造成的污染等現(xiàn)象，這使楊梅的食用存在一定的安全隱患。

有研究者發(fā)現(xiàn)，即食性蔬菜中肺炎克雷伯氏菌的檢出率為8.5%[29]，這與楊梅10%的檢出率相似。肺炎克雷伯氏菌是醫(yī)院分離的最常見的一種條件致病菌，易感染呼吸道、腸道、皮膚軟組織等多部位，此菌在院內(nèi)臨床上研究較多，而在水果如楊梅中鮮有報(bào)道。有研究報(bào)道，在韓國(guó)健康成人的腸道中肺炎克雷伯氏菌的檢出率為21.1%[30]，在臺(tái)灣健康人的糞便中肺炎克雷伯氏菌檢出率高達(dá)75%[31]。現(xiàn)在肺炎克雷伯氏菌在楊梅中有檢出，推測(cè)其可能通過食物途徑感染人體，所以對(duì)楊梅安全性進(jìn)行檢測(cè)很有必要。

隨著抗生素的大量使用，肺炎克雷伯氏菌對(duì)臨床常用β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類的藥物耐藥性不斷增高[32-33]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，楊梅攜帶的肺炎克雷伯氏菌對(duì)氨芐西林耐藥率最高(88.89%)，對(duì)哌拉西林、亞胺培南和阿米卡星敏感率較高，這與呂爽等[34]研究臨床分離的肺炎克雷伯氏菌耐藥結(jié)果相似。

在革蘭氏陰性菌中，β-內(nèi)酰胺酶基因容易由MGEs介導(dǎo)傳播[35]，而實(shí)驗(yàn)檢出的8株肺炎克雷伯氏菌均有blaTEMβ-內(nèi)酰胺類藥物獲得性耐藥基因，這可能會(huì)增加菌株的耐藥性。gyrA基因突變會(huì)使喹諾酮類藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)增加[36]，這也許是菌株產(chǎn)生喹諾酮類藥物耐藥性的原因之一。