王 雪， 王 冉， 王 曄， 丁東玲， 位詩(shī)棋， 鄭 艷

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 中藥資源研究所，安徽 蕪湖 241000；安徽省中藥日化產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000)

產(chǎn)于安徽省銅陵地區(qū)(包括南陵)的鳳丹皮為著名的道地藥材，是常用傳統(tǒng)皮類大宗中藥牡丹皮中的上品，藥用品質(zhì)最佳[1-3]。素有“植物癌癥”之稱的根腐病對(duì)以根入藥的多年生中藥材是毀滅性的土傳病害[4]，隨著鳳丹種植年限的增加，該病的發(fā)生日趨嚴(yán)重，腐皮鐮刀菌是引發(fā)鳳丹根腐病發(fā)生的主要病原菌，且根腐病治理中化學(xué)防治占較大比重，這嚴(yán)重影響了丹皮的質(zhì)量與產(chǎn)量[5-7]。放線菌是一類重要的微生物資源，能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，對(duì)許多細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，在生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。目前，筆者未見道地藥材基原鳳丹根腐病拮抗放線菌的研究報(bào)道。本研究針對(duì)道地產(chǎn)區(qū)采收期1～5年生鳳丹進(jìn)行根腐病拮抗放線菌的分離純化及篩選，有利于拮抗菌在鳳丹根際定殖，為鳳丹根腐病的生物防治、保障道地產(chǎn)區(qū)丹皮優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

供試土壤：利用五點(diǎn)取樣法采集牡丹皮道地產(chǎn)區(qū)安徽南陵丫山的采收期1～5年生鳳丹(經(jīng)通訊作者鑒定為PaeoniasuffruticosaAndr.，憑證標(biāo)本存安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/中藥資源研究所)根際土壤樣品。去除鳳丹植株表層土后，挖掘帶根整體植株，震蕩根部以去掉大塊的土壤和有機(jī)質(zhì)后用毛刷收集仍粘附在根表面的土壤作為根際土壤樣品。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。采回的根際土壤樣品放入無菌培養(yǎng)皿自然陰干，過2mm篩后備用。

供試菌株：鳳丹根腐病菌腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠球菌(Canidiaalbicans)由安徽師范大學(xué)中藥資源研究所微生物資源庫(kù)提供。

供試培養(yǎng)基：包括高氏一號(hào)培養(yǎng)基等在內(nèi)的多種放線菌鑒別用培養(yǎng)基[9]。

1.2 方 法

1.2.1 根際放線菌的分離、純化 參考本課題組前期研究[10]，采用稀釋涂布平板法分離樣品中的放線菌。將涂布后的平板編號(hào)，正置1h后于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14d。從培養(yǎng)后第5天起，根據(jù)菌落顏色、形態(tài)、氣生菌絲等特點(diǎn)挑選形態(tài)各異的放線菌單菌落，并進(jìn)行純化，同時(shí)于斜面培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗放線菌的篩選 初篩及復(fù)篩實(shí)驗(yàn)均采用平板對(duì)峙法。將0.1mL腐皮鐮刀菌的培養(yǎng)液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，表面晾干后備用。將培養(yǎng)5d的放線菌用無菌打孔器(直徑5mm)沿菌落同心環(huán)上打孔，挑取菌餅放入晾干后的PDA培養(yǎng)基平板上，每皿均勻放置3塊菌餅，28℃培養(yǎng)。3d后觀察抑菌情況，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次，以不接供試放線菌菌株的平板作為對(duì)照(CK)。

1.2.3 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將培養(yǎng)5d的放線菌發(fā)酵液4000r·min-1離心，用0.22μm微孔濾器過濾后取離心后的發(fā)酵液5mL與冷卻至45℃的100mLPDA迅速混勻制成帶菌培養(yǎng)基。在凝固后的平板上放入直徑6mm的茄病鐮刀菌菌餅，以無菌水處理作為對(duì)照，重復(fù)3組，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。利用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算公式：抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.2.4 對(duì)其它病原菌的抑制作用鑒定 采用平板對(duì)峙法探究抑菌活性優(yōu)良的放線菌菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠球菌的抑菌活性。

1.2.5 拮抗菌株的鑒定 放線菌菌株的鑒定包括形態(tài)特征[11]、培養(yǎng)特征[9]、生理生化及耐受性測(cè)定[12]，此外參照薛應(yīng)鈺等[13]研究方法對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序后得到的16SrDNA序列通過DNA star、EzTaxon server 2.1(http://www.eztaxon.org)、Blast程序、Mega 5.0軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析(Duncan’s新復(fù)極差法，P﹤0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 根際放線菌的分離與拮抗放線菌的篩選

從1～5年生鳳丹根際土壤中分離得到放線菌83株，經(jīng)初篩有15株放線菌對(duì)腐皮鐮刀菌有不同程度的抑菌作用，占全部放線菌的18.07%。13株1年生根際放線菌中4株具有拮抗作用，篩選率為30.77%；14株2年生根際放線菌中僅篩選得到一株拮抗菌，篩選率為7.14%；3年生和4年生根際土壤中均分離得到22株放線菌，且均有5株對(duì)根腐病菌有拮抗作用，篩選率均為23.81%；14株5年生根際放線菌中未篩選到對(duì)腐皮鐮刀菌有抑菌作用的菌株。對(duì)初篩獲得的具有拮抗腐皮鐮刀菌效果的15株放線菌進(jìn)行復(fù)篩，依據(jù)依據(jù)徐麗華等[14]對(duì)放線菌抑菌作用的判定，獲得抑菌圈在6～15mm之間(弱作用)的拮抗放線菌8株；大于等于15mm(強(qiáng)作用)的拮抗放線菌4株；其余放線菌二次篩選無抑菌效果(表1)。

表1 鳳丹根際拮抗放線菌抑菌作用

注：-：無抑菌效果；+：抑菌圈直徑6～15mm；++：抑菌圈直徑>15mm

為保證篩選菌株的抑菌穩(wěn)定性，對(duì)具有強(qiáng)抑制作用的4株放線菌進(jìn)行第三次篩選，結(jié)果如圖1所示.NL4-210-46對(duì)腐皮鐮刀菌抑制效果最佳，抑菌直徑為19.67mm，與其余菌株之間差異顯著；菌株NL1-210-35、NL3-310-44、NL4-310-35的抑菌直徑分別為15.67mm、15.67mm、16.50mm，三者之間差異不顯著。

2.3 拮抗放線菌發(fā)酵液對(duì)根腐病菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，供試4株拮抗放線菌發(fā)酵液均對(duì)根腐病菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。其中，放線菌NL4-210-46抑菌率最大為84.38%，與其他放線菌菌株抑菌率差異顯著；NL1-210-35、NL4-310-35、NL3-310-44的抑菌率分別為79.58%、78.75%、78.33%，其中NL1-210-35與NL4-310-35之間差異不顯著，與NL3-310-44差異顯著。

圖1 拮抗放線菌對(duì)根腐病病原菌抑菌效果

圖2 拮抗放線菌對(duì)根腐病病原菌菌絲體生長(zhǎng)的影響

Fig.1 Antibiotic activity of antagonistic actinomycetes Fig.2 Inhibition of antagonistic actinomycetes on

onFusariumsolanimycelial growth ofFusariumsolani

注：柱上不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s檢驗(yàn)在P﹤0.05水平差異顯著。下同。

2.4 其它菌株抑菌效果

供試四株放線菌對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠球菌三種病原菌有不同程度的抑制作用，其中NL4-210-46對(duì)三種病原菌均有抑制作用，抑菌直徑分別為11.50mm、13.67mm、15.17mm；NL3-310-44對(duì)三種病原菌無抑菌效果；NL1-210-35和NL4-310-35能抑制金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌。

2.5 菌株NL4-210-46的鑒定

2.5.1 表型特征與生理生化特征 基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)、不斷裂；氣生菌絲絲狀，多分枝；孢子絲螺旋形，孢子長(zhǎng)圓形，表面光滑。NL4-210-46在大多數(shù)培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可溶性色素，氣生菌絲乳白色或淡粉紅，基內(nèi)菌絲紫紅或粉紅(圖3)。NL4-210-46在NaCl含量大于5%的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，在pH為6.0～8.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好；能使明膠液化、水解淀粉，牛奶凝固胨化反應(yīng)呈陽性，不能產(chǎn)生H2S及黑色素，不能發(fā)生硝酸鹽還原反應(yīng)及水解纖維素；能利用木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖等碳源，不能利用甘露醇、核糖及肌醇。

表2 拮抗放線菌對(duì)三種病原菌抑菌效果

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤

2.5.2 分子生物學(xué)鑒定 NL4-210-46用通用引物擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物大小在1500bp左右，測(cè)序得出序列長(zhǎng)度為1418bp。菌株的16SrDNA序列相似性比對(duì)后構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，菌株NL4-210-46與Streptomycestauricus(公牛鏈霉菌)聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征初步將菌株NL4-210-46歸類為公牛鏈霉菌。

圖4 菌株NL4-210-46系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

目前，中藥材根腐病的拮抗放線菌篩選越來越受到關(guān)注，鏈霉菌屬灰紅紫類群是拮抗川芎根腐病病原菌的重要生防菌群[15]，Streptomycestuirus也對(duì)黃芪根腐病有較強(qiáng)抗菌活性[16]，王雪山等[17]從山東菏澤地區(qū)牡丹根際土壤樣品中采集到1株對(duì)牡丹根腐病有良好拮抗效果的放線菌株Streptomycesalbireticuli。本研究則以道地藥材基原鳳丹為研究對(duì)象，從鳳丹根際土壤中分離得到的83株根際放線菌，經(jīng)初步篩選其中15株對(duì)鳳丹根腐病菌有不同程度拮抗作用，經(jīng)多次篩選共得到4株放線菌具有良好的抑菌活性，從4年生根際土壤中獲得的NL4-210-46抑菌率達(dá)84.38%，經(jīng)形態(tài)、理化特征及16SrDNA序列分析，鑒定其為鏈霉菌屬公牛鏈霉菌。

鏈霉菌屬因其具有產(chǎn)生多種生物活性代謝物和溶解酶的能力，作為植物病害生物防治劑與植物促生菌被廣泛地應(yīng)用研究[18]。研究表明，公牛鏈霉菌對(duì)大豆菌核病菌、辣椒疫病菌、石榴枯萎病菌等多種農(nóng)作物病原菌具有較好的拮抗作用[19-20]。本研究對(duì)公牛鏈霉菌NL4-210-46的抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在對(duì)鳳丹根腐病病原菌具有較強(qiáng)抑菌活性的同時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠球菌也有一定的抑制作用，席楠等[21]報(bào)道指出公牛鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物cinerubin B對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠球菌、抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等具有較好的抑制活性，這為本研究結(jié)果提供參考。

生防菌株能否在植株根部有效定殖決定了其生防效果的好壞[22]，本研究獲得的公牛鏈霉菌NL4-210-46具有廣譜抑菌性且對(duì)鳳丹根腐病具有良好生防潛質(zhì)，因此，該菌或許能提高放線菌在土壤中的定殖能力，有效解決定殖問題，并為鳳丹根腐病的田間生物防治提供新的研究方向，對(duì)于該菌具體的生防機(jī)制、定殖能力以及毒理效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。