張 慧 郭清泉* 舒緒剛 謝 宇 譚 威 劉 迪 張亞楠

(1.廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣州510006；2.廣州天科生物科技有限公司，廣州510627； 3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州510225)

隨著人類社會的進步，養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；图s化迅速發(fā)展，為追求高產(chǎn)，防止畜禽疾病發(fā)生，提高飼料報酬，飼料添加劑應運而生。它的使用可提高動物的生產(chǎn)性能，增強機體抵抗力，進而提高養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益[1-2]。但飼料添加劑的安全毒理學評價環(huán)節(jié)尤為重要，它直接關(guān)系到人類的健康。二氫楊梅(dihydromyricetin，DMY)是黃酮醇類化合物[3-4]，它的化學名稱是3，5，7，3′，4′，5′-六羥基2，3雙氫黃酮，其結(jié)構(gòu)如圖1。它具有較高的超離域度，整個分子形成一個大π鍵共軛體系，具有強烈的配合作用。因具有抗菌、抗腫瘤、護肝、抗氧化等多方面的生理活性，近年來DMY已作為新型飼料添加劑得到廣泛的應用。鎳(Ni)是機體所必需的微量元素，主要作用是激活機體的各種酶，它具有獨特的協(xié)調(diào)和催化電子轉(zhuǎn)移特性，缺乏鎳可出現(xiàn)生長緩慢、生殖力減弱，但鎳的過量可導致心肌、腦、肺臟、肝臟和腎臟退行性變。研究發(fā)現(xiàn)DMY金屬配合物的生物活性明顯強于單一有效成分，并且可以同時補充畜禽生長必需的微量元素[5-7]，故二氫楊梅素-鎳配合物(DMY-Ni)的研究成為熱點，但目前有關(guān)DMY-Ni的研究大都停留在其工藝制備、抗氧化性、抑菌性等生物活性方面[8-9]，缺少有力的穩(wěn)定性及安全性方面的數(shù)據(jù)。20世紀80年代末，Nguyen等[10]首次建立細胞毒性檢測的方法，它是在一種離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測藥物抑制細胞生長和其他毒性作用的方法，其中噻唑藍(MTT)法最為常用，此方法簡單直觀，可分析不同組分及濃度對細胞的毒性。本試驗擬以DMY和乙酸鎳為原料合成DMY-Ni，并以小鼠肝實質(zhì)細胞為研究對象，研究DMY及DMY-Ni對體外細胞增殖的影響，旨在為安全合理將DMY-Ni用做飼料添加劑提供指導。

圖1 二氫楊梅素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of DMY

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMY：西安四季生物科技有限公司，純度98%；無水乙醇、乙酸鎳、無水醋酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純；蒸餾水：廣州屈臣氏蒸餾水公司；小鼠肝實質(zhì)細胞AML12：上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM(高糖)培養(yǎng)液、胎牛血清：美國Gibco公司；雙抗(青霉素-鏈霉素)：美國Fisher Scientific公司；胰蛋白酶：美國BioBasieUnit公司；MTT：美國Sigma公司；二甲基亞砜：上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器

DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV-2450型紫外可見分光光度計：日本島津公司；NICOLET-380型傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker公司；CO-150型INNOVA CO2培養(yǎng)箱：美國NBS公司；SpectraMax Paradigm酶標儀：澳大利亞Molecular Devices公司；高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 DMY-Ni的合成

準確稱取0.640 g(2 mmol)的DMY裝于250 mL帶有磁力攪拌子的三口圓底燒瓶中，加100 mL的無水乙醇，待加熱、攪拌完全溶解后，向該溶液中加入一定量的無水醋酸鈉調(diào)節(jié)pH約為7.5，繼續(xù)攪拌0.5 h后，加入相同物質(zhì)的量的乙酸鎳0.498g(2mmol)，在70℃的水浴下攪拌冷凝回流6 h，反應結(jié)束后放置冷卻至室溫，減壓抽濾，用蒸餾水和無水乙醇交替反復洗滌沉淀3次，然后于40 ℃下真空干燥10 h，得黃褐色固體粉末。

1.4 DMY-Ni的表征

紫外光譜表征：將DMY和所得配合物先分別用少量二甲基亞砜溶解，然后再用大量水稀釋至試驗所需濃度，以水為參比樣，在200～600 nm內(nèi)掃描紫外-可見吸收光譜。

紅外光譜表征：采用溴化鉀(KBr)壓片法分別對DMY和所得配合物進行紅外光譜掃描。

1.5 細胞毒性

取對數(shù)生長期的小鼠肝實質(zhì)細胞AML12，用DMEM(高糖)培養(yǎng)液調(diào)整至5×104個/mL，并以100 μL/孔接種到96孔板中，邊緣加磷酸鹽緩沖液(PBS)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，棄去上清，用完全培養(yǎng)基將DMY與DMY-Ni分別按試驗設(shè)定的濃度梯度配制好，每孔加入含DMY或DMY-Ni的培養(yǎng)液100 μL，并分別孵育12、24、36和48 h。試驗設(shè)定的DMY或DMY-Ni終濃度分別為10、20、40、80和160 μg/mL，每個濃度設(shè)置6個復孔，同時設(shè)置空白對照組與調(diào)零組。待作用相應時間后，棄去上清，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，放置10 min，用酶標儀測490 nm處的吸光度(OD)值，重復3次，按下列公式計算細胞增殖率：

細胞增殖率(%)=(試驗組平均OD值/ 空白對照組平均OD值)×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY-Ni的表征

2.1.1 紫外光譜掃描

由圖2可以看到，DMY在292 nm處有強吸收峰，與鎳離子配合后，吸收峰的位置移到了305 nm處，與DMY相比發(fā)生了明顯的紅移，說明DMY的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，有新的產(chǎn)物生成。

圖2 DMY和DMY-Ni的紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-vis absorption spectra of DMY and DMY-Ni

2.1.2 紅外光譜掃描

由圖3可知，3 407.78 cm-1是苯環(huán)上的羥基伸縮振動，說明生成的配合物仍存在羥基；DMY在1 642.37 cm-1處有強吸收峰，這是4位羰基產(chǎn)生的，在生成配合物時，由于4位羰基與5位羥基偶合作用，導致4位羰基碳氧雙鍵變?nèi)酰辗逦恢靡浦? 598.43 cm-1處，向低波數(shù)移動了43.94 cm-1，說明羰基參與了反應。在1 400～1 500 cm-1處苯環(huán)骨架的吸收峰位置變化不大，說明DMY和生成的配合物均存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)；在1 050～1 150 cm-1處醚鍵吸收峰位置基本不變，說明在生成配合物時C環(huán)醚鍵未發(fā)生開環(huán)；但在低頻指紋區(qū)中，生成的配合物與DMY相比，在651.87 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，表明DMY與鎳離子發(fā)生了作用，形成了以Ni-O鍵結(jié)合的配合物DMY-Ni。

圖3 DMY和DMY-Ni的紅外光譜圖Fig.3 IR-spectra of DMY and DMY-Ni

2.2 DMY與DMY-Ni對AML12細胞增殖的影響

由圖4-A可以看到，在分別經(jīng)過12、24 h的作用后，隨著DMY濃度的增加，AML12細胞的存活率基本不變；在分別經(jīng)過36、48 h的作用后，AML12細胞的存活率隨著DMY濃度的增大而減小，抑制作用并不明顯。在同一濃度下，隨著DMY作用時間的增加，AML12細胞的存活率也有所下降。由圖4-B可以看到，在分別經(jīng)過12、24 h的作用后，隨著DMY-Ni濃度的增加，AML12細胞的存活率基本保持不變，這和DMY作用于AML12細胞的情況一致。而當DMY-Ni分別作用于AML12細胞36、48 h時，在低濃度時，AML12細胞的存活率基本不變，在高濃度時，AML12細胞的存活率隨DMY-Ni濃度的增加而下降，且下降幅度較相同情況下的DMY明顯。在同一濃度不同的作用時間下，AML12細胞的存活率也是呈現(xiàn)時間依賴性。

圖5為DMY和DMY-Ni在作用48 h后對AML12細胞增殖的影響，可以看出當DMY濃度在160 μg/mL時，其對AML12細胞增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用，該組AML12細胞的存活率與空白對照組相比顯著降低(P<0.01)；DMY濃度低于160 μg/mL時，AML12細胞的存活率基本不變，與空白對照組的差異不顯著(P>0.05)。DMY-Ni濃度為80～160 μg/mL時，其對AML12細胞表現(xiàn)出了一定的毒性作用，這2組AML12細胞的存活率與空白對照組相比差異顯著(P<0.01或P<0.001)；DMY-Ni低于80 μg/mL時，AML12細胞的存活率基本不變，與空白對照組的差異不顯著(P>0.05)。通過GraphPad Prism 7.0軟件計算半數(shù)抑制濃度(IC50)，得出DMY對AML12細胞的IC50為285.10 μg/mL，DMY-Ni對AML12細胞的IC50為222.84 μg/mL，稍低于DMY的IC50，說明配合物DMY-Ni對AML12細胞的毒性較DMY有所增大。

3 討 論

DMY與鎳離子配合后，其紫外-可見吸收光譜發(fā)生了明顯的紅移現(xiàn)象，紅外吸收光譜在指紋區(qū)有新的特征吸收峰出現(xiàn)，是Ni—O鍵，從而證明了DMY-Ni配合物的生成。

圖4 DMY和DMY-Ni對AML12細胞增殖的影響Fig.4 Effects of DMY and DMY-Ni on proliferation of AML12 cells

與空白對照組相比，差異性顯著表示為：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

Compared with the blank control group, the differences are significantly expressed as: *,P<0.05; **,P<0.01; ***,P<0.001.

圖5DMY和DMY-Ni作用48h后對AML12細胞增殖影響

Fig.5 Effects of DMY and DMY-Ni on proliferation of AML12 cells after treatment for 48 h

劑量是毒理學研究中最重要的概念。DMY-Ni作為飼料添加劑使用，研究其量效關(guān)系非常重要。有研究顯示化學物質(zhì)體外細胞毒性與其引起的動物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間都存在良好的相關(guān)性?；瘜W物質(zhì)產(chǎn)生的損傷和死亡，最終可表現(xiàn)為細胞水平上的改變，由此研究體外細胞毒性可以預測體內(nèi)急性毒性。

周防震等[11]從細胞水平證明了DMY的低毒性，作用48 h時，DMY對L-02細胞的IC50為324.8 μg/mL；舒洋[12]通過MTT法檢測了DMY對2種正常人永生化肝細胞增殖的影響，結(jié)果顯示DMY對正常人肝細胞沒有明顯的抑制作用；蘇東林等[13]以受試樣品最大使用濃度、受試動物最大灌胃容量為試驗用量，即Wistar大鼠口服灌胃DMY 5.0 g/kg BW，結(jié)果沒有動物死亡，解剖也未發(fā)現(xiàn)有組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地的改變，從而證明了DMY的低毒性。但對于DMY的使用，目前并沒有明確規(guī)定其安全劑量。

DMY與鎳離子結(jié)合后其抗氧化、抑菌性等生物活性方面均有加強，對于其安全性方面，本試驗采用MTT法，研究得出DMY對AML12細胞的IC50為285.10 μg/mL。由于同一種藥物，作用于不同的細胞株，其耐受性也會有差異[14-15]。故本試驗結(jié)果仍可看作與上述文獻報道相一致，即DMY具有低毒性。本試驗中得出DMY-Ni對AML12細胞的IC50為222.84 μg/mL，雖然DMY-Ni的IC50較DMY減小，但相差并不大，從這些結(jié)果對比來看，DMY和DMY-Ni對正常細胞確實具有低毒性。

由于DMY-Ni的IC50比DMY減小了，證明其毒性有所增加。有研究表明，DMY金屬配合物與其配體DMY相比，金屬離子與配體DMY產(chǎn)生了協(xié)同作用，其抗腫瘤活性提高[16]，這也可能是DMY-Ni對正常小鼠肝實質(zhì)細胞AML12毒性相較于其配體DMY增加的原因。

4 結(jié) 論

① 以DMY和乙酸鎳為原料，本試驗成功合成了配合物DMY-Ni。

② DMY與DMY-Ni對AML12細胞的抑制作用與藥物濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，且隨作用時間的延長，毒性逐漸增大。

③ DMY對AML12細胞具有低毒性，DMY-Ni對AML12細胞的毒性較DMY有所增加，但也是低毒性。