王希春 儲小燕 張婭菲 朱 雷 范夢雪 馮士彬 李 玉 吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥230036)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又稱為嘔吐毒素，是由多種鐮刀菌侵染小麥和玉米等谷類作物產(chǎn)生的一種有毒次級代謝產(chǎn)物，由于其在食物鏈中具有高水平暴露和高污染頻率特性而受到極大關(guān)注[1-2]。DON作為谷物中檢出率和檢出量最高的霉菌毒素，對人類和動物的健康構(gòu)成了嚴重威脅[3]。通過研究DON對動物流行病學的影響，食品科學委員會(SCF)在2002年已經(jīng)設(shè)定了DON的每日可接受攝入量(TDI)為1.0 μg/kg[4]。研究表明，DON對動物的毒性作用主要體現(xiàn)在損害免疫系統(tǒng)、胃腸道和大腦的健康[5]。當豬攝入DON后，表現(xiàn)為采食量下降，體重增加緩慢，攝入的DON至少有67%被吸收，表明豬對DON有高度敏感性[6]。Lessard等[7]給仔豬飼喂DON污染飼糧，發(fā)現(xiàn)回腸中主要抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶2(GPx-2)基因表達上調(diào)，而編碼酶的抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶3(GPx-3)、超氧化物歧化酶3(SOD-3)基因表達下調(diào)，表明DON對仔豬腸道免疫系統(tǒng)具有一定的毒性作用。盡管有人認為成年家畜對DON具有一定的耐受性，但DON對仔豬的毒害作用尤其是對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷卻不容忽視。Gaigé等[8]試驗證明，腦是DON的敏感區(qū)域，也是激活神經(jīng)元的區(qū)域，下丘腦和腦干能調(diào)節(jié)DON引起的反應(yīng)。耿芳芳等[9]研究報道，DON可影響雛雞腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)的分泌，同時改變神經(jīng)細胞中鈣離子(Ca2+)和組織中鈣調(diào)蛋白(CaM)含量及組織中CaMmRNA相對表達量，表明DON體內(nèi)暴露可對雛雞產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性。

研究發(fā)現(xiàn)，DON對胃腸道黏膜細胞和淋巴細胞等均具有一定的損傷作用[1,10]。目前DON對動物體內(nèi)和體外毒性作用的研究較多，而關(guān)于DON對神經(jīng)細胞毒性作用的體外研究尚未見報道。由于豬是對DON最敏感的試驗動物，而海馬神經(jīng)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最容易受外界因素影響而受損的區(qū)域，因此，本試驗以仔豬海馬神經(jīng)細胞(piglet hippocampal nerve cells，PHNCs)為對象，研究DON染毒后對細胞中神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過氧化及鈣穩(wěn)態(tài)的影響，以探討DON誘導(dǎo)的仔豬海馬神經(jīng)細胞毒性作用，為進一步闡明DON的毒性機理提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

仔豬海馬神經(jīng)細胞購自賽齊生物有限公司；DON標準品(濃度大于99%)購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone有限公司；胎牛血清、二甲基亞砜購自美國Clark有限公司；胰酶細胞消化液購自碧云天生物技術(shù)公司；5-HT、DA、乙酰膽堿(ACH)、γ-氨基丁酸(GABA)、NE、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自上海源葉生物科技有限公司；Ca2+、CaM試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。

CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；微量移液器購自美國Eppendorf公司；Multiskan Mk3型酶標儀購自上海賽默飛世爾儀器有限公司；TGL-18R臺式高速離心機購自珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司；超凈工作臺購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機購自寧波新芝科器研究所；Arktik多功能PCR儀購自美國Thermo公司。

1.2 仔豬海馬神經(jīng)細胞的培養(yǎng)和分組

將1 mg DON用無菌水配制成1 mg/mL DON基礎(chǔ)工作液，將其加入到DMEM高糖培養(yǎng)基中，配制DON質(zhì)量濃度分別為0、125、250、500、1 000 和2 000 ng/mL的工作液。于25 cm2正方細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用DMEM高糖培養(yǎng)基(添加體積分數(shù)10%的胎牛血清和適量抗生素)培養(yǎng)仔豬海馬神經(jīng)細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2。將生長狀態(tài)良好的仔豬海馬神經(jīng)細胞用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至細胞密度為5×105個/mL，接種于6孔板內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)24 h，然后再用配制好的不同質(zhì)量濃度的DON處理細胞24 h后，收集處理后的細胞用于神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過氧化及鈣穩(wěn)態(tài)指標的檢測。

1.3 神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過氧化指標的檢測

仔豬海馬神經(jīng)細胞染毒培養(yǎng)24 h后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。之后向每個樣品中加入500 μL含0.1% Triton X-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)，在冰水浴中進行超聲裂解。將細胞裂解液以l 000 r/min離心10 min，收取上清液，按照試劑盒說明書中操作步驟進行測定，用酶標儀讀取波長450 nm的吸光度(OD)值，利用測得的標準曲線計算細胞中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、ACH、GABA、NE含量，脂質(zhì)過氧化指標CAT、GSH-Px、SOD活性和T-AOC及NO、MDA含量。

1.4 鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)指標的檢測

1.4.1 細胞中Ca2+、CaM含量檢測

仔豬海馬神經(jīng)細胞染毒培養(yǎng)24 h后，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌并懸浮細胞，在冰水浴中進行超聲裂解。將裂解后的細胞懸液以3 000 r/min離心3 min，收取上清液，部分保存于-20 ℃冰箱，部分進行蛋白濃度測定，之后按照Ca2+檢測試劑盒(甲基麝香草酚藍微板法)和豬CaM檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附測定法)說明書中操作步驟進行測定，用酶標儀讀取波長450 nm的OD值，計算細胞中Ca2+和CaM含量。

1.4.2 細胞中CaMmRNA表達量檢測

將接種于6孔細胞培養(yǎng)板的仔豬海馬神經(jīng)細胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度的DON染毒處理24 h后，吸棄培養(yǎng)板中的液體，向每孔中加入1 mL Trizol裂解液，用無RNase槍頭反復(fù)吹打，提取RNA；RNA使用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix在42 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，85 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，獲得所需cDNA。

根據(jù)GenBank中發(fā)布的豬CaM(NM_001244209.1)和18S RNA(NR_046261.1)全基因序列，運用Prime 5.0軟件設(shè)計特異性上、下游引物，并利用GenBank BLAST進行同源性檢索，之后由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。引物序列及參數(shù)見表1。

表1 CaM目的基因和18S RNA內(nèi)參基因引物參數(shù)

參照StepOneTMReal-time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix配制PCR反應(yīng)體系，然后按以下程序進行PCR擴增：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。熔解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，每10 s以0.5 ℃的速度由55 ℃升溫至98 ℃。試驗組的目的基因CaM和內(nèi)參基因18S RNA均在同一參數(shù)下進行3個重復(fù)試驗。以無DON處理的仔豬海馬神經(jīng)細胞為內(nèi)參(設(shè)定其表達水平為1)，采用2-△△CT法計算試驗組仔豬海馬神經(jīng)細胞CaMmRNA相對表達量，其中△△Ct的計算公式為:

△△Ct=(Ct試驗組CAM基因-Ct試驗組18S RNA基因)-

(Ct對照組CAM基因-Ct對照組18S RNA基因)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD進行差異顯著性檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。運用GraphPad Prism 5.0數(shù)據(jù)軟件進行柱狀圖的繪制。

2 結(jié) 果

2.1 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

不同濃度DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響見表2。由表可知，隨DON濃度的增加，5-HT、DA、ACH、GABA含量均呈升高趨勢，而NE含量呈降低趨勢。與對照組相比，當DON濃度為1 000 ng/mL時，5-HT、DA、ACH含量顯著升高(P<0.05)，GABA含量極顯著升高(P<0.01)，而NE含量顯著降低(P<0.05)；當DON濃度為2 000 ng/mL時，5-HT、DA、ACH含量極顯著升高(P<0.01)。

2.2 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中脂質(zhì)過氧化指標的影響

不同濃度DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中脂質(zhì)過氧化指標的影響見表3。由表可知，隨DON濃度的增加，CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量呈降低趨勢，而MDA含量呈升高趨勢。與對照組相比，當DON濃度為250 ng/mL時，SOD活性和T-AOC極顯著降低(P<0.01)；當DON濃度為1 000 ng/mL時，GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，NO含量極顯著降低(P<0.01)，而MDA含量極顯著升高(P<0.01)；當DON濃度為2 000 ng/mL時，CAT活性顯著降低(P<0.05)，GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)。

2.3 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中Ca2+和CaM含量的影響

不同濃度DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中Ca2+和CaM含量的影響見圖1。由圖可知，隨DON濃度的增加，Ca2+和CaM含量呈升高趨勢。與對照組相比，當DON濃度為125 ng/mL時，Ca2+含量有升高趨勢(P>0.05)，CaM含量極顯著升高(P<0.01)；當DON濃度為250 ng/mL及以上時，Ca2+含量極顯著升高(P<0.01)。

表2 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

同列數(shù)據(jù)無肩標表示與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values with no superscripts mean no significant difference compared with control group (P>0.05), while with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

表3 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞脂質(zhì)過氧化指標的影響

2.4 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中CaM mRNA相對表達量的影響

不同濃度DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中CaMmRNA相對表達量的影響見圖2。由圖可知，與對照組相比，當DON濃度為125 ng/mL時，CaMmRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)；當DON濃度為250 ng/mL及以上時，CaMmRNA相對表達量極顯著升高(P<0.01)，說明DON濃度的增加會促進細胞中CaMmRNA的表達。

3 討 論

DON是一種B型單端孢霉烯族類毒素，主要由鐮刀菌次生代謝產(chǎn)生，廣泛污染植物源性產(chǎn)物，如農(nóng)產(chǎn)品和飼料[11-12]。研究證明，DON對原核細胞和真核細胞都有顯著的毒性作用[13-14]。國內(nèi)外已有很多關(guān)于DON對動物腦、胃腸道、生殖系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)的研究，而對豬神經(jīng)細胞毒性作用的研究仍不深入，本試驗選用仔豬海馬神經(jīng)細胞作為研究對象，來探討DON染毒后對神經(jīng)細胞中神經(jīng)遞質(zhì)、脂質(zhì)過氧化及鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)指標的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，DON能夠通過血腦屏障到達腦部，通過刺激腦部不同區(qū)域?qū)е履X組織異常。較低慢性劑量DON會引起豬厭食，較高急性劑量DON會引起豬嘔吐[15]。DON能影響大腦神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，研究表明，位于腦和胃腸道中的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT可能參與調(diào)節(jié)DON誘導(dǎo)的某些效應(yīng)[16]。Swamy等[17-18]研究報道，DON會引起斷奶仔豬腦橋NE含量降低，下丘腦和腦橋5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)含量升高；腦部5-HT含量升高，與NE含量呈相反趨勢。本試驗研究結(jié)果表明，不同濃度DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞攻毒24 h后，細胞中5-HT、DA、ACH、GABA含量隨DON濃度的增加呈升高趨勢，而NE含量呈降低趨勢，這與以上報道相一致。

A：DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中Ca2+含量的影響；B：DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中CaM含量的影響。數(shù)據(jù)柱標注*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

A: Effects of DON on the content of Ca2+in PHNCs; B: Effects of DON on the content of CaM in PHNCs. Data column with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean significant difference compared with control group (P<0.01). The same as below.

圖1DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中Ca2+和CaM含量的影響

Fig.1 Effects of DON on the contents of Ca2+and CaM in PHNCs

圖2 DON對仔豬海馬神經(jīng)細胞中 CaM mRNA相對表達量的影響Fig.2 Effects of DON on the relative expression level of CaM mRNA in PHNCs

抗氧化系統(tǒng)在動物機體中占很重要的地位[19]。已有研究證明，對小鼠進行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)DON會降低小鼠腦抗氧化系統(tǒng)活性，并遭受氧化應(yīng)激[20]。Kanbur等[21]研究表明，聯(lián)合使用玉米赤霉烯酮(ZEA)和DON，可使小鼠產(chǎn)生自由基，并影響機體的抗氧化功能。Ren等[22]對小鼠進行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)攻毒組的腦組織MDA含量升高，腦組織SOD、GSH-Px活性降低，表明小鼠腦功能受DON的影響。耿芳芳等[23]對雛雞進行DON攻毒，發(fā)現(xiàn)腦組織CAT、SOD、GSH-Px活性，T-AOC及NO含量顯著降低，而MDA含量顯著升高。本試驗研究證明，DON暴露降低仔豬海馬神經(jīng)細胞CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量，升高MDA含量，這與上述研究結(jié)果相符。

鈣穩(wěn)態(tài)是指機體正常代謝過程中細胞內(nèi)游離Ca2+濃度與細胞外Ca2+濃度之間較恒定的梯度差，是維持細胞完整性和功能的主要因素[24]。神經(jīng)細胞內(nèi)異常增加的Ca2+作為第二信使，通過多途徑鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起涉及蛋白質(zhì)修飾的短時程反應(yīng)和改變基因表達的長時程適應(yīng)性反應(yīng)[25]。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+最主要的結(jié)合蛋白是CaM。Ca2+-CaM復(fù)合物可以調(diào)節(jié)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶、蛋白磷酸酶、腺苷酸環(huán)化酶、一氧化氮合酶等酶的活性，進而改變突觸蛋白的活性，或通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制激活相應(yīng)的基因表達，參與多種細胞內(nèi)信號反應(yīng)等病理過程[26-27]。任志華等[28]研究表明，DON暴露能夠增加雞脾臟淋巴細胞中Ca2+含量和CaMmRNA表達量，且均顯著或極顯著高于對照組，表明DON能引起雞淋巴細胞中鈣穩(wěn)態(tài)失衡，這與本試驗結(jié)果是一致的，表明DON能夠刺激仔豬海馬神經(jīng)細胞，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡。

4 結(jié) 論

綜上所述，通過體外暴露試驗表明，DON可促進仔豬海馬神經(jīng)細胞中神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA、ACH和GABA的分泌，抑制NE的分泌；升高細胞脂質(zhì)過氧化指標MDA含量，降低CAT、GSH-Px、SOD活性，T-AOC和NO含量；同時增加神經(jīng)細胞中Ca2+和CaM含量以及CaMmRNA基因相對表達量，并呈劑量依賴關(guān)系。上述結(jié)果表明DON暴露可對仔豬海馬神經(jīng)細胞產(chǎn)生一定的神經(jīng)毒性。