高慶濤 張 虎 趙 峰* 王鈺明 杜青之 鄧耀輝

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193； 2.湖南中本智能科技發(fā)展有限公司，長沙410013)

國家標準GB/T 6379.1—2004規(guī)定測量方法與結(jié)果的準確度包括重復(fù)性和再現(xiàn)性2個方面[1]。在同一實驗室，由同一操作員使用相同的設(shè)備和測試方法進行獨立檢測的精密度稱為重復(fù)性；而在不同的實驗室，由不同的操作員使用不同的設(shè)備，按相同的方法進行獨立檢測的精密度稱為再現(xiàn)性，它們是確定方法是否可行的重要依據(jù)。Bourdillon等[2]建立的歐洲肉雞飼糧代謝能值測定方法中，4個飼糧的氮校正表觀代謝能(AMEn)值在7個實驗室間的平均變異系數(shù)為2.92%。Carabao等[3]采用Boisen等[4]的方法體外模擬家兔的消化過程，獲得8個樣品4個實驗室間干物質(zhì)消化率(DMD)的平均變異系數(shù)為3.24%。這表明，實驗室間測定飼料養(yǎng)分生物學(xué)效價的再現(xiàn)性變異相對較大。對于動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室開發(fā)的單胃動物仿生消化系統(tǒng)測試結(jié)果的重復(fù)性，李輝等[5]采用第1代單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS-1)在同一實驗室內(nèi)測鴨飼料酶水解物能值(EHGE)的批內(nèi)與批間變異系數(shù)均不超過1.40%。趙峰等[6]采用第2代單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS-2)測定4種雞飼料原料EHGE的批內(nèi)與批間變異系數(shù)均不高于1.64%。由此可見，SDS-2重復(fù)性是滿意的。然而，在不同實驗室間，試驗環(huán)境條件并非完全一致，其測試結(jié)果的再現(xiàn)性需要進一步佐證。為此，本研究通過比較4個實驗室間SDS-2模擬豬消化過程中的緩沖液流速、消化液流速、清洗液流速和開機后溫度、混合頻率變化曲線等消化條件以及EHGE測定的再現(xiàn)性，探討SDS-2在不同實驗室間測試結(jié)果的再現(xiàn)性能否達到定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 飼料原料

采集玉米、大豆粕各2.5 kg，用萬能粉碎機粉碎后過60目方形篩孔。樣品采用抽真空充氮避光包裝，普通條件運輸至各實驗室，并于實驗室內(nèi)-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ衩?、大豆粕的概略養(yǎng)分與總能值見表1。

表1 玉米、大豆粕的概略養(yǎng)分與總能值(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗設(shè)計

所有實驗室SDS-2均按照生長豬仿生消化過程的消化參數(shù)設(shè)置[7]，且保持一致。根據(jù)SDS-2的設(shè)計原理[8-9]，對實驗室間儀器內(nèi)2組仿生消化管路的緩沖液流速、清洗液流速、消化液流速的差異采用嵌套設(shè)計，其中一級處理因素為實驗室，共設(shè)4個，每個實驗室1臺SDS-2，二級處理因素為SDS-2內(nèi)2個仿生消化組，每個處理進行3次重復(fù)測定。對SDS-2酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室、消化液儲存室的溫度通過溫度傳感器檢測，混合頻率通過電磁傳感器測定。實驗室間飼料的DMD和EHGE的差異，采用完全隨機設(shè)計，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管。

1.3 仿生消化中消化條件的測定

緩沖液流速的測定：在SDS-2的1號蠕動泵轉(zhuǎn)速設(shè)置為60 r/min時，泵轉(zhuǎn)動2 min后通過量筒計量第1個和第2個仿生消化組管路泵入去離子水的體積，每組重復(fù)測定3次。

清洗液流速的測定：在SDS-2的2號蠕動泵轉(zhuǎn)速設(shè)置為180 r/min時，泵轉(zhuǎn)動2 min后通過量筒計量第1個和第2個仿生消化組管路泵入去離子水的體積，每組重復(fù)測定3次。

消化液流速的測定：1)模擬小腸液注入流速，用移液器往1～10號加液管中加入2 mL去離子水，開啟3號蠕動泵，用秒表記錄液體完全泵入模擬消化器的時間，重復(fù)測定3次。2)模擬大腸液注入流速，用移液器往11～20號加液管中加入2 mL去離子水，開啟4號蠕動泵，用秒表記錄液體完全泵入模擬消化器的時間，重復(fù)測定3次。

溫度與混合頻率的監(jiān)測：由溫度傳感器、電磁傳感器通過SDS-2控制軟件采集仿生消化過程中酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室、消化液儲存室的溫度變化曲線及搖床混合頻率的變化曲線。

1.4 飼料EHGE的測定

豬模擬消化液試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室提供，采用低溫運輸。實驗室4 ℃保存?zhèn)溆?。模擬消化液消化酶活性及仿生消化測定飼料DMD和EHGE的方法參考《單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊》(第2版)[7]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)單因素完全隨機設(shè)計原理，用SAS 9.0的MEANS模塊對基本統(tǒng)計量進行分析，根據(jù)嵌套設(shè)計原理，用ANOVA模塊對流速進行方差分析。用GLM模塊對各處理下飼料原料的DMD和EHGE進行方差分析，平均值通過Duncan氏法進行多重比較；實驗室內(nèi)變異系數(shù)、實驗室間變異系數(shù)及總變異系數(shù)參照蔣紅衛(wèi)等[10]方法計算。數(shù)據(jù)計算公式及統(tǒng)計模型如下：

嵌套設(shè)計統(tǒng)計模型為：

Yijk=μ+Li+B(L)ij+εijk。

單因素方差分析統(tǒng)計模型為：

Yij=μ+Li+εij。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同實驗室間SDS-2消化條件實測值的再現(xiàn)性

由表2可見，在SDS-2控制參數(shù)的測定中，實驗室間胃、小腸、大腸緩沖液流速以及清洗液流速無顯著性差異(P>0.05)，但仿生消化組間的胃、小腸、大腸緩沖液流速及清洗液流速有顯著性差異(P<0.01)。其中實驗室2、3和4在2個仿生消化組的胃緩沖液流速上有顯著性差異(P<0.05)，相差16～18 mL/min；實驗室3和4在2個仿生消化組的小腸和大腸緩沖液流速上有顯著性差異(P<0.05)，相差12～18 mL/min；實驗室1、2和4在2個仿生消化組的清洗液流速上有顯著差異(P<0.05)，相差3～35 mL/min。實驗室間小腸和大腸消化液流速有顯著性差異(P<0.05)，其中實驗室1和4的小腸和大腸消化液流速均顯著高于實驗室2和3(P<0.05)。2個仿生消化組間的小腸消化液流速有顯著性差異(P<0.05)，而大腸消化液流速無顯著性差異(P>0.05)。

4個實驗室SDS-2開機后仿生消化的混合頻率及酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室、消化液儲存室溫度的變化曲線如圖1。由圖1-A可見，實驗室3的初始混合頻率最低(79 r/min)，實驗室1的初始混合頻率最高(135 r/min)，實驗室2和4的初始混合頻率居中(平均為108 r/min)；開機6 min以后，4個實驗室的混合頻率均能達到預(yù)設(shè)的180 r/min，并維持這一混合頻率。由圖1-B可見，實驗室3的緩沖液控溫室初始溫度最低(20.9 ℃)，實驗室1的緩沖液控溫室初始溫度最高(39.1 ℃)，實驗室2和4的緩沖液控溫室初始溫度居中(28.0～29.1 ℃)；開機60 min后，4個實驗室的緩沖液控溫室溫度均趨于設(shè)定值(39.0 ℃)。由圖1-C可見，實驗室3的酶促反應(yīng)室初始溫度最低(19.0 ℃)，實驗室1的酶促反應(yīng)室初始溫度最高(38.1 ℃)，實驗室2和4的酶促反應(yīng)室初始溫度居中(28.8～29.8 ℃)；開機后24～36 min，4個實驗室的酶促反應(yīng)室的溫度均趨于設(shè)定值(39.0 ℃)。實驗室3在開機后42～48 min因酶促反應(yīng)室的操作門打開溫度從39.0 ℃急劇下降至31.0 ℃，關(guān)閉操作門后在開機60 min后再次趨于設(shè)定值。由圖1-D可見，實驗室1的消化液儲存室初始溫度最低(8.9 ℃)，實驗室2和4的消化液儲存室初始溫度最高(28.2～29.6 ℃)，實驗室3的消化液儲存室初始溫度居中(17.9 ℃)，開機12 min后，4個實驗室的消化液儲存室溫度在3.9～11.4 ℃內(nèi)變化。

表2 4個實驗室間SDS-2消化條件實測值的差異

相同項目同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。表3同。

In the same item and column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as
Table 3.

2.2 實驗室間SDS-2測定飼料DMD和EHGE的再現(xiàn)性

由表3可見，在玉米的仿生消化中，4個實驗室間的DMD和EHGE均沒有顯著性差異(P>0.05)，分別介于78.03%～78.69%和15.43～15.63 MJ/kg。玉米DMD的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)及總變異系數(shù)均低于1.23%。玉米EHGE的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)及總變異系數(shù)均低于0.99%。

在大豆粕的仿生消化中，4個實驗室間的DMD和EHGE均有顯著性差異(P<0.01)，分別介于58.36%～61.58%和13.14～13.62 MJ/kg。大豆粕DMD的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)及總變異系數(shù)分別為1.30%、2.23%和2.52%。大豆粕EHGE的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)及總變異系數(shù)分別為0.89%、1.43%和1.64%。

3 討 論

3.1 SDS-2消化條件的控制及變異因素

在體外模擬消化中，消化條件將直接影響模擬消化的程度及其與體內(nèi)消化的相關(guān)性[11]。然而，在傳統(tǒng)的以三角瓶為反應(yīng)器的模擬消化液中，不同研究者在同種動物體外消化條件的設(shè)置上并不統(tǒng)一[12]。即使是自動化程度高的體外消化系統(tǒng)在使用上也鮮見關(guān)于設(shè)定消化條件與實際消化條件是否吻合方面的報道[13]。本試驗中，所有實驗室的SDS-2在消化條件參數(shù)的設(shè)置上是一致的，但仿生消化實測的消化條件與設(shè)置的消化條件的接近程度受參與控制過程的電器元件自身控制精度的影響。根據(jù)國家標準GB/T 6379.1—2004[1]關(guān)于測定再現(xiàn)性的定義，不同實驗室間的SDS-2在設(shè)置的消化條件參數(shù)一致的前提下，仿生消化實測的消化條件上也是有變異的，從而影響到再現(xiàn)性的程度。

圖1 4個實驗室間SDS-2消化條件實測值的變化曲線Fig.1 Curve of determined values of digestion condition of SDS-2 among 4 laboratories

從SDS-2的設(shè)計原理看，同一臺SDS-2的2組仿生消化組中，緩沖液、模擬小腸液及模擬大腸液泵入模擬消化器分別由蠕動泵1、3、4提供動力，每次清洗需要的去離子水由2號蠕動泵定量泵取[7](表4)。2組仿生消化組都是通過同軸同步的雙泵頭為溶液的泵入提供動力，因此，脈沖流量主要受泵管磨損程度及管路阻力的影響。本研究組前期試驗結(jié)果表明，當新泵管裝入泵頭(6滾輪)在60 r/min下運行180 h后，流速從160 mL/min降至140 mL/min，并趨于穩(wěn)定。這一現(xiàn)象與蠕動泵是通過泵頭滾輪脈沖擠壓泵管提供泵入動力的原理有關(guān)。新泵管擠壓空間較大，脈沖流量也相對較大；當泵管經(jīng)泵頭擠壓一段時間后，空間變小并趨于穩(wěn)定，因此脈沖流量也相應(yīng)地變小并趨于穩(wěn)定。此外，進入模擬消化器循環(huán)的胃、小腸、大腸緩沖液是由3組(每組2個)電磁閥的開關(guān)來控制的，管道的長短與電磁閥觸點擠壓會影響到液體流動的阻力。本試驗中，緩沖液的流速在130～156 mL/min間變化，實驗室間在緩沖液的平均流速上無顯著差異，而在同一臺儀器的2組仿生消化組間有顯著差異。這表明，實驗室間SDS-2在緩沖液流速上總體一致，但在2組仿生消化組間存在差異。從單胃動物仿生消化的原理看，飼料與消化液在透析袋內(nèi)，緩沖液在透析袋外通過蠕動泵泵入循環(huán)，當緩沖液循環(huán)速度大大超過透析袋內(nèi)外物質(zhì)交換的速度時，緩沖液流速的差異將不會導(dǎo)致透析袋內(nèi)物質(zhì)帶走及消化產(chǎn)物對仿生消化抑制程度的差異，同時由于上樣量與緩沖液的比例為5～10 g∶1 000 mL，緩沖液流速的差異不會引起緩沖液中水解產(chǎn)物濃度的差異。在本試驗的SDS-2中，緩沖液7～8 min循環(huán)1次，2個仿生消化組緩沖液流速的差異約需要50 min才引起緩沖液循環(huán)相差1次，而透析袋內(nèi)外物質(zhì)交換的速度約40 min。因此，本試驗條件下緩沖液流速的差異將不會導(dǎo)致消化率的差異。在消化液流速中，實驗室間存在顯著差異。根據(jù)單胃動物仿生消化的原理，每根模擬消化器泵入的模擬小腸消化液、模擬大腸消化液均為2 mL，為了把所有消化液完全泵入模擬消化器中，對10通道的蠕動泵(3、4號)，以通道的最低流速作為消化液泵入速度，從而保證2 mL消化液能完全泵入模擬消化器，從而消除流速差異對仿生消化的影響。仿生消化后，清洗水解產(chǎn)物所用去離子水的體積與上樣量比例為300 mL：1～2 g，累計清洗4次。若同一臺SDS-2中2個仿生消化組的清洗液流速相差40 mL/min，則泵取1 500 mL去離子水后體積相差150 mL以內(nèi)，折算到每根消化管相差30 mL。按照每根消化管上樣量2 g，DMD為75%計算，則

共計通過清洗液帶出的物質(zhì)為1.5 g。由于采用逐級清洗，則理論上2組仿生消化組未清洗出的消化物質(zhì)量相差量為：1.5×(20/350)4-1.5×(20/320)4<0.000 1 g。由此可見，在清洗液總體積相對樣品量大很多時，通過4次逐級清洗后，即使清洗液泵入體積每次相差10%，但未清洗出物質(zhì)的差異可以忽略不計。李輝等[5]的試驗結(jié)果證明了同一臺SDS-2中，2個仿生消化組對同一樣品的消化率無顯著性差異，這表明SDS-2在當前設(shè)計及電器元件條件下的溶液流速變異不會引起EHGE測定值的差異。

表3 4個實驗室間玉米和大豆粕DMD和EHGE測定值的差異

表4 SDS-2溶液泵入所用蠕動泵的參數(shù)

實驗室間SDS-2的初始混合頻率有所差異，這是由于電機的實際電容量有所差異，導(dǎo)致電機加電啟動時轉(zhuǎn)速不同。加電運行6 min后，各實驗室的混合頻率能達到設(shè)定要求。實驗室間酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室及消化液儲存室的初始溫度相差較大，除實驗室1屬于SDS-2剛運行1個消化周期，緊接著開展本試驗外，其他3個實驗室都是SDS-2未經(jīng)開機運行開展的本試驗。因此，實驗室1在酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室及消化液儲存室都與設(shè)定參數(shù)很接近。而其他3個實驗室的初始溫度條件都接近自身的實驗室溫度條件。緩沖液控溫室達到設(shè)定溫度所需要的時間比酶促反應(yīng)室及消化液儲存室達到設(shè)定溫度的時間長，這是因為水的熱容量比空氣的熱容量大。雖然各實驗室的環(huán)境溫度相差較大，但經(jīng)過60 min運行后，溫度條件都能達到設(shè)定要求。因此，SDS-2的開機預(yù)熱時間設(shè)為60 min，可以排除實驗室間環(huán)境溫度對仿生消化的影響。

3.2 SDS-2測定飼料原料DMD和EHGE的再現(xiàn)性

在仿生消化方法中，盡管不同實驗室間的模擬消化參數(shù)、消化過程的控制都一致，且最大限度地減少了人為操作引起的干擾，但在實際測定中不同實驗室間在試驗用水規(guī)格、氧彈計測定總能值、操作人員熟練程度等方面均有差異。在同一實驗室條件下，趙峰等[6]的試驗結(jié)果表明，雞仿生消化法測定玉米、小麥、棉籽粕的DMD和EHGE的批內(nèi)、批間變異系數(shù)及總變異系數(shù)均不超過1.00%。Carabao等[3]采用三角瓶體外模擬消化法在4個實驗室測定兔飼糧DMD的實驗室內(nèi)變異系數(shù)為1.73%，實驗室間的變異系數(shù)為3.24%。Bourdillon等[2]測定歐洲7個實驗室間雞飼糧的干物質(zhì)含量、總能、氮含量及雞表觀代謝能的變異系數(shù)分別為1.27%、1.29%、4.39%和2.92%。Getachew等[14]采用產(chǎn)氣法測定7個實驗室間24 h產(chǎn)氣量的變異系數(shù)為7.88%。本試驗仿生消化法測定玉米的DMD、EHGE的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)均在1.23%以內(nèi)，且實驗室間無顯著性差異。大豆粕的DMD、EHGE的實驗室內(nèi)、實驗室間變異系數(shù)均在2.23%以內(nèi)，實驗室間在DMD與EHGE上有顯著差異，且DMD的極差、變異系數(shù)比能量消化率的相應(yīng)值大。這可能與各實驗室在仿生消化過程中清洗產(chǎn)物時所用的水不一致有關(guān)(實驗室通常使用2類試驗用水：市售桶裝純凈水、膜過濾去離子水)。此外，在仿生消化方法中，大豆粕上樣量為1 g，而玉米上樣量為2 g，從數(shù)據(jù)的計算上也使得大豆粕的測定值誤差比玉米高1倍，從而也增加了實驗室間的差異。盡管如此，與前述方法相比，本仿生消化方法在實驗室間的再現(xiàn)性更好。

4 結(jié) 論

① 雖然實驗室間SDS-2在消化液流速有顯著差異，但不會引起飼料原料EHGE測定結(jié)果的差異。4個實驗室間SDS-2開機運行60 min后混合頻率及酶促反應(yīng)室、緩沖液控溫室、消化液儲存室的溫度均達到一致。

② 實驗室間玉米EHGE的再現(xiàn)性高于大豆粕，2個飼料原料EHGE的總變異系數(shù)都可控制在1.64%以內(nèi)，具有滿意的再現(xiàn)性。