陳 璐 趙艷麗 郭曉宇 史彬林 閆素梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

乳糖是牛奶的主要成分，是限制牛奶產(chǎn)奶量的關(guān)鍵因素之一，在一定范圍內(nèi)產(chǎn)奶量隨著乳糖合成的增加而增加[1-3]。氨基酸(AA)是合成乳蛋白的主要前體物，在影響乳蛋白合成的同時，也對乳糖合成產(chǎn)生影響[4]。賴氨酸(Lys)是乳蛋白合成主要的必需氨基酸(EAA)，也是奶牛的限制性氨基酸[5]。因此，深入研究Lys對乳糖合成的影響及機理，對調(diào)節(jié)乳腺內(nèi)乳成分的合成和增加產(chǎn)奶量具有重要意義。王麗娜[6]發(fā)現(xiàn)以奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)為模型，在培養(yǎng)基中添加EAA可同時促進了乳蛋白和乳糖的合成。云伏雨[7]研究表明，在奶牛飼糧中添加適宜水平的Lys可以提高產(chǎn)奶量、乳蛋白率和乳糖率?？梢姡琇ys在一定程度上影響了乳糖的合成，但前人的研究多集中在向奶牛體內(nèi)灌注Lys及體外培養(yǎng)添加Lys影響乳蛋白合成的方面，對體外添加Lys影響乳糖合成及其機理方面的探索研究甚少，有必要對此進行深入研究。鑒于此，本研究以BMECs為模型，研究不同濃度Lys對乳糖合成相關(guān)基因表達的影響，為進一步探討Lys對BMECs內(nèi)乳糖合成的影響機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試驗主要試劑：Ⅱ型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)，購自Gibco公司；賴氨酸(Lys，L8662)、氫化可的松、表皮生長因子、催乳素、瓊脂糖，購自Sigma公司；RNAiso PLUS、PrimeScript RT Master Mix和SYBR Premix ExTaqTMⅡ，購自TaKaRa公司；牛D乳糖酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(EHJ-90716h)，購自廈門慧嘉生物技術(shù)有限公司。

試驗主要儀器：二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Forma-311，Thermo)、倒置顯微鏡(Olympuse，日本)、全自動酶標(biāo)儀(Synergy H4 BioTek，美國)及熒光定量PCR儀(ABI-7500，美國)。

1.2 原代BMECs體外培養(yǎng)與試驗設(shè)計

在內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真屠宰場選取3頭3～5歲經(jīng)產(chǎn)的健康泌乳中期的高產(chǎn)荷斯坦奶牛乳腺組織，參考Sheng等[8]的膠原酶消化法獲得和培養(yǎng)BMECs，當(dāng)原代細胞貼壁率達到80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶/EDTA對細胞進行純化和傳代。將第3代的BMECs按照試驗要求的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板上(5×105個/孔)，以含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。采用單因子隨機試驗設(shè)計，當(dāng)細胞貼壁率達到80%～90%時，換為無血清的DMEM/F12饑餓培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，將細胞分為6個組，在每組中加入不同濃度的Lys工作液，使反應(yīng)體系中Lys終濃度分別為0.5(對照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L，每組6個重復(fù)，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。各組DMEM/F12培養(yǎng)基中亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸濃度分別為0.45、0.13、0.25、0.70、0.42、0.22、0.45、0.04和0.45 mmol/L，Lys的濃度參考高海娜等[9]和李喜艷[10]的研究結(jié)果并通過測定細胞增殖率[RGR(%)=試驗組OD490/對照組OD490×100]確定。

1.3 測試指標(biāo)與方法

BMECs內(nèi)乳糖的含量采用雙抗體夾心法測定。將細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板上，按試驗設(shè)計培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液，按照牛D乳糖ELISA試劑盒說明書的方法步驟測定細胞培養(yǎng)液中乳糖含量，即根據(jù)梯度稀釋法用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將1.8 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1 200、800、400、200和100 μg/L 5個濃度，每個濃度分別在酶標(biāo)包被板上加2個孔(50 μL/孔)，再向待測樣品孔中加入40 μL樣品稀釋液，之后加入10 μL待測樣品，用封板膜封板置于37 ℃培養(yǎng)箱溫育30 min；溫育結(jié)束后，棄液體甩干，用洗滌液清洗5次，在每孔中加入50 μL酶標(biāo)試劑，溫育30 min，再洗滌；每孔加入50 μL顯色劑A，之后加入50 μL顯色劑B，37 ℃避光顯色15 min，每孔再加入50 μL終止液，以空白孔調(diào)零，用全自動酶標(biāo)儀測定OD450，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乳糖的含量。

BMECs內(nèi)總RNA按照Trizol法提取。將細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，按試驗設(shè)計培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀檢測RNA的純度與濃度，OD260/OD280在1.8～2.2范圍內(nèi)表示RNA純度較好。RNA完整性用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒的方法進行，反轉(zhuǎn)錄體系為10 μL?；虮磉_量采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的方法進行測定，反應(yīng)體系為20 μL。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白(β-actin)和18S核糖體RNA(18S rRNA)為管家基因，對乳糖合成相關(guān)基因α-乳清白蛋白(LALBA)、β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1(β-4GALT1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運載體蛋白1 (GLUT1)、已糖激酶Ⅰ(HKⅠ)和已糖激酶Ⅱ(HKⅡ)的相對表達量進行測定，其引物序列見表1。實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為：95.0 ℃預(yù)變性30 s；95.0 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸20 s，進行40個循環(huán)反應(yīng)；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，51個循環(huán)，繪制熔解曲線。實時熒光定量PCR結(jié)果用GAPDH、β-actin和18S rRNA這3個管家基因的幾何平均值進行分析，基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算得出。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)通過Excel 2010進行計算整理，采用SAS 9.0軟件的方差分析(ANOVA)程序進行顯著性檢驗，同時用回歸統(tǒng)計程序進行一次線性與二次曲線回歸分析，P<0.05表示組間的差異或回歸關(guān)系顯著，0.050.10表示組間的差異或回歸關(guān)系不顯著。

表1 乳糖合成相關(guān)基因的引物序列

2 結(jié) 果

表2的結(jié)果表明，BMECs內(nèi)乳糖含量隨著Lys濃度的增加呈顯著的二次曲線升高(P=0.016)，回歸方程為y=102.481 83+15.765 10x-0.885 87x2(R2=0.777 0)，x為Lys濃度，y為乳糖含量，其中以2.0～16.0 mmol/L組乳糖含量較高，趨于顯著高于對照組(0.050.05)。

3 討 論

在體外研究中，乳腺組織不能通過糖異生合成葡萄糖[15]，只能從血液吸收獲得，因此，添加Lys對BMECs內(nèi)乳糖合成的影響僅能通過調(diào)控作用來完成。本研究發(fā)現(xiàn)，添加Lys對乳糖含量的促進效果呈顯著的二次曲線升高(回歸方程中R2=0.777 0)，方差分析結(jié)果顯示，不同濃度Lys趨于顯著地提高乳糖含量，即在適宜濃度范圍內(nèi)，乳糖含量隨著Lys濃度的增加而增加，在4.0 mmol/L時促進效果最好，再隨著濃度的進一步增加，其促進效果減弱，說明Lys對乳糖合成的促進作用呈顯著的劑量依賴關(guān)系。

表2 Lys對BMECs內(nèi)乳糖合成及相關(guān)基因表達量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。P<0.05表示回歸關(guān)系顯著；0.050.10表示回歸關(guān)系不顯著。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).P<0.05 means significant regression; 0.05 0.10 means not significant regression.

乳腺對葡萄糖的攝取是調(diào)控乳產(chǎn)量的限速步驟，GLUT1是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，己糖激酶(HKs)是利用葡萄糖的限速酶，可以催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，HKⅠ和HKⅡ是HKs在乳腺組織中發(fā)現(xiàn)的2種基因表達[16]，并且HKⅡ的基因表達與葡萄糖攝取密切相關(guān)[17]。Fueger等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HKⅡ基因過表達后促進葡萄糖吸收。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lys濃度對GLUT1與HKⅡ基因表達的促進作用呈顯著的一次線性升高，8.0～16.0 mmol/L Lys顯著促進GLUT1與HKⅡ基因表達，而1.0～2.0 mmol/L Lys抑制HKⅡ基因表達；Lys對HKⅠ基因表達的影響呈顯著的一次線性降低，2.0 mmol/L Lys促進其表達，高劑量具有抑制作用，與趙艷麗[19]的研究結(jié)果相似，即亮氨酸可促進HKⅠ基因表達，但高劑量抑制其表達；這些結(jié)果說明，Lys可能促進葡萄糖攝取和磷酸化。結(jié)果也得出，添加Lys可趨于顯著增加乳糖含量，但高劑量的促進效果減弱，可能與適宜濃度Lys促進葡萄糖攝取與磷酸化，而高劑量抑制HKⅠ基因表達有關(guān)，這進一步解釋了Lys對乳糖合成的作用效果呈劑量依賴關(guān)系的原因。

乳糖合成酶由β-4GALT1及LALBA組成，LALBA是乳糖合成酶中的調(diào)節(jié)亞基，調(diào)控乳糖合成與分泌；β-4GALT1是催化亞基，只有在LALBA存在的條件下，才能發(fā)揮作用，催化UDP-半乳糖與葡糖糖以β-1,4糖苷鍵形成乳糖，控制著乳糖合成效率，進而調(diào)節(jié)乳產(chǎn)量[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，2.0～8.0 mmol/L Lys顯著促進LALBA和β-4GALT1基因表達，而16.0 mmol/L Lys的促進作用減弱，與Lys促進乳糖含量的結(jié)果相吻合，因此進一步解釋了BMECs內(nèi)乳糖含量的增加可能與Lys促進LALBA和β-4GALT1基因表達有關(guān)。

綜上所述，Lys對乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表達的促進作用存在劑量依賴關(guān)系，并且乳糖含量以2.0～16.0 mmol/L Lys、GLUT1基因表達量以4.0 ～16.0 mmol/L Lys、HKⅡ基因表達量以8.0～16.0 mmol/L Lys、LALBA和β-4GALT1基因表達量以2.0～8.0 mmol/L Lys的促進效果較好，但16.0 mmol/L Lys對LALBA和β-4GALT1基因表達的促進作用減弱，1.0～2.0 mmol/L Lys顯著抑制HKⅡ基因表達，4.0～16.0 mmol/L Lys抑制HKⅠ基因表達。因此，Lys濃度為2.0～8.0 mmol/L時，對BMECs內(nèi)乳糖合成促進效果較好。

4 結(jié) 論

Lys對乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表達量的影響呈劑量依賴關(guān)系，以濃度為2.0～8.0 mmol/L時促進效果較好，但濃度為16.0 mmol/L時抑制了HKⅠ基因表達，且減弱了對乳糖合成的促進作用。