董小娜 陳澤慧 毛林強 王明新 張文藝

摘 要：

以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受試對象，考察了從太湖土著激蕩魚內(nèi)臟中篩選的溶藻菌R1菌（Lysinibacillus macroides）的溶藻特性，通過chla測定、三維熒光技術，采用高溫處置、酸堿處置、透析處置手段，HPLC分離技術，考察了溶藻效果、溶藻產(chǎn)物、溶藻機制及溶藻活性物質。結果表明：菌株R1具有較強的溶藻特性，10 d內(nèi)chla含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達82.64%；采用熒光強度表征溶藻率，10 d溶藻率達89.80%，與chla表征的溶藻率82.64%相近；R1溶藻活性物質是細菌分泌的胞外耐高溫類物質，為小分子物質（Mr<500 da），具有耐酸性堿性；熒光圖譜EMMs結合平行因子PARAFAC模型譜分析顯示溶藻過程中色氨酸增加，腐殖酸大量減少；主要溶藻產(chǎn)物為長波類類色氨酸類物質，主要為細胞的胞內(nèi)物質；推測溶藻活性物質疏水性氨基酸（hydrophbic acid）；通過HPLC分離技術，從R1粗提液中分離出1餾分溶藻活性物質，成分還需要進一步的鑒定。

關鍵詞：

溶藻細菌；銅綠微囊藻；熒光圖譜；平行因子模型；溶藻機制

中圖分類號：X703；S182

文獻標志碼：A 文章編號：16744764（2018）05011707

收稿日期：20171113

基金項目：

國家自然科學基金（41571471），江蘇省高校自然科學研究項目（16KJB610001），江蘇省及常州市科技項目（BE2016653、CE20175009）

作者簡介：

董小娜（1992），女，主要從事環(huán)境工程水處理研究，Email： 170856287@qq.com。

張文藝（通信作者），男，博士，教授，Email： zwy@cczu.edu.cn

Received：20171113

Foundation item：

National Natural Science Foundation of China（No. 41571471），University Natural Science Research Project in Jiangsu Province（No. 16KJB610001）， Science and Technology Project of Jiangsu Province and Changzhou City（No. BE2016653，No.CE20175009）

Author brief：

Dong Xiaona（1992）， main research interests： water treatment and environmental engineering， （Email）： 170856287@qq.com.

Zhang Wenyi（corresponding author），PhD，professor， （Email）：zwy@cczu.edu.cn.

Algicidal characteristics of algicidal bacteria R1

Dong Xiaona， Chen Zehui， Mao Linqiang，Wang Mingxin， Zhang Wenyi

（College of Environmental & Safety Engineering， Changzhou University， Changzhou 213164，Jiangsu，P.R，China）

Abstract：

Microcystis aeruginosawas used as the experimental subject to examine the algaelysing characteristics of algicidal bacteria R1（Lysinibacillus macroides） ，which was isolated and purified from Taihu fish innards， named Surf fish. The ability of algaelysing， the degradation products， algaelysing mechanism and active algicidal substances were studied with the measurement of chlorophyll a and the three dimensional fluorescence technology， the whole experimental process was carried out through high temperature treatment， acid and alkali treatment， dialysis treatment and HPLC separation technique. The results show that the strain R1 can remove Microcystis aeruginosa effectively. The contents of chla decrease from 205.11 mg/L to 35.61 mg/L in 10 days， with degradation rate of 82.64%. The degradation rate is 89.8% measured by 3D flurescence technology in 10 d， which is similar to the result measured by measuring Chlorophylla. The fluorescence spectrometric analysis shows that the tryptophan increases and the humic acid decreases significantly. The main dissolved algal products are longwave class tryptophan， which are mainly intracellular substances.The soluble alga may be hydrophobic acid. The active algaelysing substances produced by R1 with molecular weight less than 500 da， are identified as bacteria secretion， could resist acid and be promoted in alkaline conditions. Active substance was separated from R1 crude extract by HPLC，and a further identification was necessary to be processed.

Keywords：

algicidal bacteria； microcystis aeruginosa； fluorescence spectrum； PARAFAC mode； algicidal mechanism

每年夏秋季一些水體均發(fā)生有害藻華（HAB）暴發(fā)，給水環(huán)境生態(tài)帶來極大威脅，探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌（algicidal bacteria）溶藻安全高效，具有廣闊前景。近年來，學者們在溶藻菌的篩選、溶藻活性代謝產(chǎn)物分析、溶藻微生物的溶藻機理等方面的研究相當活躍，包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻性質的描述、溶藻方式的探討、溶藻活性物質的分離與純化[12]以及溶藻機理的研究等。尤其溶藻機理的研究更是深入到基因水平（分子水平）：藻細胞的細胞水平[34]、功能酶和蛋白水平[56]等。近年來溶藻菌的篩選成果頗多[7]，已分離鑒定出來的菌屬有粘細菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等[8]，因藻類的暴發(fā)與溶藻菌的生長息息相關，這些溶藻菌多來自藻華頻繁暴發(fā)地帶。細菌溶藻方式主要有2種：直接溶藻與間接溶藻，見諸報道的溶藻菌多具有間接溶藻特性[9]。對溶藻能力的測定方法有：藻細胞數(shù)量的變化、chla含量的變化及其采用藻膽蛋白（某些藻類如藍藻）的含量變化等。對溶藻機理的研究越來越多，眾多分析方法被用于揭示溶藻產(chǎn)物溶藻機理，如：傅里葉紅外光譜、熒光光譜、透射電鏡等[10]。細菌分泌的物質（如氨基酸、抗生素、多肽等）[11]成分復雜，不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不盡相同，這讓溶藻活性物質的分離純化非常困難，目前分離純化出有效溶藻物質罕見報道。報道的溶藻活性物質的分離純化主要有2種方法：硅膠柱層析[12]與高效液相色譜（HPLC）方法[13]。對活性物質的鑒定方法有液質聯(lián)用（LCMS）[13]、液相二級質譜（LCMSMS）等。但這還僅僅只是限于實驗室研究階段，在實踐中直接利用的效果并不理想，其活性物質的分離純化困難且收集率低，這使得生物菌劑投產(chǎn)與使用都難以實現(xiàn)。

采用三維熒光技術對藻膽蛋白的測定來表征溶藻效果，借助三維熒光光譜解析溶藻降解產(chǎn)物；通過對菌液進行熱處置、破碎處置、酸堿處置、透析處置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻機理；并通過HPLC技術初步分離提取了有效溶藻物質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 藻種來源：銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）購自中國科學院武漢水生生物研究所。

菌種來源：從太湖激浪魚內(nèi)臟（魚鰓、魚腸等）中篩選出了1株溶藻效果較佳的菌株R1，培養(yǎng)2 d后，菌落呈圓形，直徑大約1～2 mm，白色，表面光滑，微微凸起，邊緣光滑，生長快速；革蘭氏染色呈紫色，為陽性菌（如圖1），經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析，其與Lysinibacillus macroides相似性最高，達99.50%。

圖1 R1革蘭氏染色

Fig.1 Gram's stain of R1[]

1.1.2 主要儀器和試劑 1）試劑：試劑均為中國產(chǎn)分析純試劑。

2）儀器：離心機、超聲波細胞粉碎機、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計UV1800、Cary Eclipse熒光分光光度計等。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 LB培養(yǎng)基[14]、銅綠微囊藻培養(yǎng)基BG11[15]

1.2 方法

1.2.1 菌株溶藻能力考察 為探索菌株R1的溶藻效果，取10 mL培養(yǎng)24 h的R1菌液接種到100 mL銅綠微囊藻溶液中（初始chla含量為20511 mg/L），27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培養(yǎng)，每天定期手動搖晃2～3次，每隔2 d測得chla含量變化，通過式（1）[16]計算溶藻率并繪制曲線，同時做空白對照。

η=（Cc-Ct）/Cc×100%（1）

式中：η為溶藻率，%；Cc為初始chla含量，mg/L；Ct為后期chla含量，mg/L。

1.2.2 三維熒光考察溶藻效果

通過測定chla含量的方法考察溶藻效果較為繁瑣，測定時間較長，且需要耗費許多提取物；使用顯微鏡觀察藻細胞形態(tài)數(shù)量是最傳統(tǒng)的浮游藻類分析方法，該方法工作量大，比較繁瑣，且有時辨別不清[17]。銅綠微囊藻有很強的熒光特性的藻膽蛋白，是一種卟啉類色素蛋白，卟啉具有π電子結構[9]，在特定的波長照射下有很強的熒光反應。熒光光譜分析方法快速、準確、樣品不需要特別處置、簡單高效。銅綠微囊藻細胞具有如下熒光特性：藻密度與發(fā)射波長無關[18]，在低濃度下，熒光強度與溶液濃度成正比，可進行定量分析[1820]。

為表征菌株溶藻過程，對菌藻混合液（參照121）進行了三維熒光譜圖分析，取菌藻混合液，進行三維熒光掃描，發(fā)射波長（簡稱Em）280～900 nm/280～550 nm，激發(fā)波長（簡稱Ex）220～800 nm/220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；

每隔一段時間收集混合液測Em為650 nm的三維熒光光譜，通過式（2）[21]計算溶藻率并繪制曲線。

η=（Fc-Ft）/Fc×100%（2）

式中：η為溶藻率，%；Fc為藻膽蛋白初始光強，A.U；Ft為后期藻膽蛋白的光強，A.U。

1.2.3 三維熒光圖譜EMMs結合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物

為表征菌株溶藻產(chǎn)物，對降解后的藻液進行了三維熒光譜圖分析，發(fā)射波長（簡稱Em）280～550 nm，狹縫寬度為2 nm；激發(fā)波長（簡稱Ex）220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；同時，考察純藻液及其菌液的熒光特性。EEMs分析物質鑒定，主要采用目視鑒定，無法避免光譜重疊帶來的誤差且具有主觀性。采用三維熒光圖譜結合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物：1）數(shù)據(jù)預處理：并用Delauay三角形內(nèi)插值法瑞利散射及拉曼散射。2）平行因子分析：平行因子算法是基于三線性分解理論，采用交替最小二乘原理，進行迭代的三維數(shù)陣分解算法?？梢詫⒁粋€由多個三維熒光光譜矩陣分解為3個方向的載荷矩陣。通過對半檢驗法（splithalf analysis），殘差平方和的最小，及核一致性檢驗來確定模型的有效性。采用MATLAB軟件中的Nway toolbox運行[2224]。

1.2.4 菌株的溶藻特性

為探討溶藻細菌的溶藻機制，將培養(yǎng)24 h溶藻細菌R1培養(yǎng)液進行如下處理：

1）離心過濾上清液（8 000 r/min，10 min；過022 μm濾膜）、高熱處理上清液（121 ℃，20 min）、菌體破碎液（取離心后的菌體沉淀超聲波破碎）[16]。

2）酸堿化處置[12]：為考察pH對溶藻物質活性的影響，分別調(diào)節(jié)菌液pH為4、7、10，處置1 h后調(diào)回中性，同時做不加菌的空白對照，接菌量為10%（體積），采用多孔細胞培養(yǎng)板（biologix 24孔板）進行溶藻實驗，并采用顯微鏡計數(shù)法檢查溶藻效果。

3）截留分子量[12]：為考察溶藻活性物質的分子大小，分別采用截留分子量為100、500、1 000 da的透析袋對培養(yǎng)24 h后的菌液進行透析1 d，取透析袋中截留液于裝載銅綠微囊藻溶液的24孔板中，檢查溶藻效果。

1.2.5 溶藻活性物質的純化與分離[13]

1）菌液前處理：接種菌株R1至500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、135 r/min，培養(yǎng)24 h；采用045 um的濾膜過濾；收集菌液并加入4倍體積的乙醇進行萃取，磁力攪拌30 min，后靜置2 h；使用0.22 um的濾膜過濾；收集菌液60 ℃旋轉蒸發(fā)；無菌水重溶，4 ℃保存。

2）HPLC：通過液相色譜初步確定可能性溶藻物質。色譜條件為：色譜柱wonda sil C18（4.6×250 mm），流動相A（甲醇）∶B（1%乙酸）為1∶9，檢測波長為UV200 nm。

3）為考察這幾個物質是否含有溶藻活性物質，每隔一段時間收集1餾分，氮氣吹干，超純水重溶，并采用24孔板進行溶藻效果檢驗。對有溶藻活性的收集液，再次使用HPLC檢查其純度及其峰值。

2 結果與討論

2.1 菌株R1的溶藻能力

將R1菌液到銅綠微囊藻溶液中（初始chla為205.11 mg/L）進行實驗，通過肉眼觀察顏色變化及chla含量測定檢驗溶藻效果，如圖2。實驗4 d后，肉眼可見混合液發(fā)生黃化現(xiàn)象，chla含量不斷減少，10 d后剩余chla含量僅為35.61 mg/L，降解率達82.64%；同時觀察到空白樣顏色更加深綠，經(jīng)測定chla含量，從初始205.11 mg/L增長到324.56 mg/L。

2.2 三維熒光分析R1溶藻能力

取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液進行三維熒光光譜掃描并分析，如圖3。溶藻過程中藻膽蛋白熒光峰Em/Ex為650 nm/630 nm，熒光光強不斷減少。為表征其溶藻效果，通過固定Em為650 nm，將得到的熒光光譜減去去離子水的熒光光譜以去除瑞利散射的影響，將瑞利散射峰置零[18]，采用oringin8.6擬合得到光強與激發(fā)波長的關系圖，如圖4。按照式2）計算，10 d溶藻率為達89.80%，與通過chla表征的溶藻率82.64%相近，可作為溶藻細菌溶藻效率的一種評價方法。

2.3 菌株R1溶藻機制研究

1）由表1及圖5（1）看出：R1菌原液、離心上清液、高溫滅菌液都發(fā)生了明顯的黃化現(xiàn)象，溶藻效果顯著；菌體破碎液及菌體沒有溶藻效果；可見，其溶藻物質并不是胞內(nèi)物質，也不是菌株本身，而是細菌分泌的胞外物質，具有耐高溫的特性，推測為非蛋白質類物質。

2）由表2及圖5（2）看出，經(jīng)過不同處置的R1菌液都具有很強的溶藻效果，與空白對比，藻液均發(fā)生明顯的黃化現(xiàn)象；顯微鏡計數(shù)結果見表2，從表中可見，藻細胞數(shù)量都明顯減少，由此可見，溶藻活性物質性質穩(wěn)定，具有耐酸耐堿性。

3）經(jīng)100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液，顯微鏡計數(shù)結果見表3，發(fā)現(xiàn)溶藻能力強弱順序依次為100 da>500 da>1 000 da，其中，1 000 da溶藻活性很低，由此可見，細菌分泌的有效溶藻物質為小分子物質，分子量小于500 da。

2.4 三維熒光圖譜結合平行因子模型分析R1溶藻

產(chǎn)物

菌株R1溶藻過程中，Em/Ex為400～600 nm/250～450 nm處出現(xiàn)了大面積的熒光反應，熒光光譜不成規(guī)則的圓形，成分復雜，如圖3。分別對銅綠微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液進行三維熒光光譜掃描，三維矩陣圖譜見圖6，分別為藻細胞產(chǎn)生的溶解性代謝性產(chǎn)物（EOM）（Em/Ex 335 nm/280 nm）、R1菌液的主要溶解性熒光組分（Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435～475 nm/350～380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm）及溶藻產(chǎn)物組分（Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm）。

運用PARAFAC模型結合EMMs圖譜對溶藻產(chǎn)物的三維熒光矩陣進行解析，并通過殘差和最小分析法及裂半分析法，識別出溶藻混合液共含有可分為2個類型。分別為：475 nm/250～350 nm；330 nm/220～270 nm，對應及類色氨酸類物質[2224]。這2個成分的熒光圖譜及激發(fā)發(fā)射波長載荷見圖7。從圖中可見，2個熒光成分的激發(fā)載荷圖譜具有2個激發(fā)峰和1個發(fā)射峰，主要體現(xiàn)了長波類腐殖質及色氨酸物，分析其溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測出，藻細胞死亡后，胞內(nèi)的物質及細胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其化學形成原理（由-COOH、-OH基團的有機化合物合成的結果），其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，結合其分子量及極性特征猜測可能為小分子的疏水性氨基酸（hydrophbic acid）。

2.5 溶藻活性物質的分離與純化

溶藻活性物質的分離難度大，目前溶藻物質的分離純化的報道目前還很少。本研究通過采用高效液相色譜（HPLC）技術分離提純粗提液，掃描波長200 nm的色譜圖，見圖8。圖中具有多個物質峰，可見經(jīng)前處理的菌液成分仍很復雜。每分鐘收集1餾分，旋轉蒸發(fā)，超純水重溶，并采用24孔板進行溶藻效果檢驗。其中有1餾分具有溶藻效果，見如9，其在既定條件下有個主要峰，保留時間分別為6.005。結合熒光光譜分析，結合熒光光譜分析，其屬于某種疏水性酸類。由于HPLC分離效率低，分離量極少而且成本很高，分離的餾分中仍還有其他成分，其溶藻物質仍需進一步分離及鑒定。

3 結論

1）從太湖土著激蕩魚內(nèi)臟中篩選的R1菌（Lysinibacillusmacroides），以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受試對象，10 d內(nèi)chla含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達82.64%。高溫處置、酸堿處置、透析處置手段確定R1菌通過分泌耐高溫的非蛋白類物質溶藻，屬于間接溶藻，且該物質具有耐酸耐堿性，其分子量小于500 da。

2）熒光光譜能夠很好的表征銅綠微囊藻含量的變化，其熒光物質為藻膽蛋白。溶藻過程中其強度不斷減少，可見藻細胞不斷被破壞，數(shù)量被不斷減少。固定Em為650 nm，通過熒光激發(fā)光譜圖對藻細胞密度進行定量分析。通過熒光光強表征溶藻效果，避免了傳統(tǒng)藻類測量過程的繁瑣，具有重要意義。熒光光譜分析表明溶藻活性物質可能為疏水性酸。溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測出，藻細胞死亡后，胞內(nèi)的物質及細胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其成分（含有-COOH、-OH基團的有機化合物）猜測，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，可能為某種疏水性氨基酸（hydrophbic acid）。

3）采用高效液相色譜（HPLC）技術分離提純粗提液（掃描波長200 nm），分離結果表明，從R1粗提液中分離出的1餾分溶藻活性物質，其在既定條件下其出峰時間為6～8 min左右，推測其為某種酸類物質，但這需要進一步的分離和鑒定。

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