榮新山，何敏，王從彥*，李彥，戴志聰，梁止水，萬凌云，郜志勇，姜坤，伍丙德，張璐，周嘉偉

1. 江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院/環(huán)境健康與生態(tài)安全研究院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2. 東南大學(xué)土木工程學(xué)院 江蘇 南京 210096；3. 青海碧城生態(tài)環(huán)境科技有限公司, 青海 西寧 810001

草原生態(tài)系統(tǒng)是全球面積最大的陸地生態(tài)系統(tǒng)，約占全球陸地面積的1/2，在全球生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面扮演著極其重要的角色（Reeder et al.，2002）。藏北高原擁有遼闊的天然草地資源，各類天然草地面積達(dá)4.8×106hm2，占羌塘高原（即藏北高原）土地面積的 81%和西藏自治區(qū)天然草地面積的59%，為西藏自治區(qū)的主要牧區(qū)（胡自治，2000）。然而，由于青藏高原高寒地區(qū)的氣候和地理位置具有特殊性，形成高寒草原獨(dú)有的生態(tài)特性，即結(jié)構(gòu)簡單、修復(fù)能力差、穩(wěn)定性弱，且易受外界因素干擾（白瑪玉珍，2016）。其中，高寒草原是青藏高原17種草地類型中面積最大的草地類型，但也是生態(tài)環(huán)境最為敏感和脆弱的亞類（曹櫻子等，2012）。因此，在人類因素（如過度放牧、圍欄定居、城鎮(zhèn)道路建設(shè)和野生生物資源的亂挖濫采等）和自然因素（如病蟲害、風(fēng)蝕、水蝕、凍融、氣候變化等）雙重作用下，藏北高寒草地退化程度比較高，不僅嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)厣鐣⒔?jīng)濟(jì)和環(huán)境健康與生態(tài)安全的可持續(xù)發(fā)展，而且對青藏高原以及全國的江河、氣候、生態(tài)環(huán)境均有直接和間接的多重影響（邵偉等，2008；高清竹等，2010；趙貫鋒等，2013）。

草原退化的重要標(biāo)志之一是草原土壤質(zhì)量退化，特別是土壤微生物多樣性明顯下降（邵偉等，2008；趙貫鋒等，2013）。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)進(jìn)程的主要參與者（Wang et al.，2017a，2017b）。作為生物圈與非生物圈物質(zhì)與能量交換的重要樞紐（單文俊等，2016），土壤微生物對生態(tài)環(huán)境的微小變化非常敏感，可提前警示生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的變化（Wang et al.，2017a）。其中，細(xì)菌和真菌共同組成超過90%的土壤微生物生物量（Rinnan et al.，2009）。因此，探究藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌和真菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)組成對評價其生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。

基于此，本研究運(yùn)用宏基因組學(xué)方法，基于高通量測序技術(shù)，對藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行對比分析。

1 研究地區(qū)概況和研究方法

1.1 研究區(qū)概況

藏北那曲地區(qū)位于西藏自治區(qū)北部，總面積3.954×105km2，占西藏自治區(qū)總面積的32.82%，孕育了長江、怒江、瀾滄江等多條大江大河及藏北高原的內(nèi)流河與眾多湖泊。年平均氣溫-2.9～3.4 ℃，年平均降水298.6～708.4 mm，年蒸發(fā)量高于1500 mm，年日照時數(shù) 2400～3200 h。自然條件具有冬季寒冷且多風(fēng)沙、夏季溫度不高但日溫差大、高寒、少雨、干旱、缺氧和紫外線強(qiáng)等特點(diǎn)（高清竹等，2010；白瑪玉珍，2016）。主體土壤類型為高山草甸土，植被類型主要屬高寒草甸類型（趙玉紅等，2012）。草原是該地區(qū)生態(tài)重要性最高、面積最大的生態(tài)系統(tǒng)（高清竹等，2010），但該地區(qū)未退化的草原面積占比已低于50%，其中輕度退化草原占比約30%，中度退化草原占比約15%，而重度或極重度退化草原占比約 10%，且草原退化速度每年達(dá)3%～5%（白瑪玉珍，2016）。

1.2 土壤樣品采集

取樣地位于那曲地區(qū)申扎縣約10 km的藏北退化高寒草原（30°55′～30°56′N，88°37′～88°38′E）。采用五點(diǎn)混合取樣法采集土壤樣品，取樣深度為0～10 cm，3次重復(fù)。首先，隨機(jī)選取5個10 m×10 m的樣區(qū)，將每一樣區(qū)平均分為九格，然后在中間一格以及任意周邊兩格采集3份土壤樣品，而后將每一樣區(qū)采集的3份土壤樣品進(jìn)行均勻化處理后形成一份總的土壤樣品。本試驗(yàn)共收集5份土壤樣品。去除土壤樣品中的根系、碎石等雜物后將土壤樣品裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存，以進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3 土壤化學(xué)成分組成和土壤粒徑分布分析

土壤化學(xué)成分組成委托玄武巖纖維生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心進(jìn)行分析，分析方法為全譜直讀等離子光譜分析法。土壤粒徑分布采用篩分法進(jìn)行分析。

1.4 土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

土壤細(xì)菌和真菌多樣性委托北京百邁客生物科技有限公司以高通量測序技術(shù)進(jìn)行測定分析，并進(jìn)一步利用高通量測序技術(shù)對土壤細(xì)菌（16S rDNA V3和 V4 區(qū)域）（Hugerth et al.，2014）和真菌（ITS1區(qū)域）（Shi et al.，2014）群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics（version 22.0；IBM Corp.，Armonk，NY，U.S.A.）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其中數(shù)據(jù)指標(biāo)間的差異水平采用One-way ANOVA分析（3組及以上數(shù)據(jù)指標(biāo)間的差異水平采用Student-Newman-Keuls test多重比較進(jìn)行分析），顯著性水平均設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)成分組成和土壤粒徑分布

藏北退化高寒草原土壤化學(xué)成分組成以 SiO2為主，占比為63.5%（圖1）。

圖1 土壤化學(xué)成分組成Fig. 1 Soil chemical composition

藏北退化高寒草原土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間土壤顆粒占比為51%（圖2）。

2.2 土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

藏北退化高寒草原土壤中，細(xì)菌的多樣性（以Shannon’s diversity index表征）、豐富度（以O(shè)TU richness表征）和相對豐度（以 ACE index(Abundance-based coverage estimator)和Chao1 index表征）均顯著高于真菌（P＜0.0001；圖3）。

在門分類級別，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是相對豐度最高的3類土壤細(xì)菌種類（P＜0.05），占比分別為44.9%、16.4%和14.5%（圖4a）；而子囊菌門（Ascomycota）、其他類（Other）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是相對豐度最高的 3類土壤真菌種類（P＜0.05），占比分別為71.5%、14.3%和8.3%（圖4b）。

圖2 土壤顆粒級配曲線示意圖Fig. 2 Diagram of soil particle grading curven=3

3 討論

由于嚴(yán)酷的水熱條件、強(qiáng)烈的風(fēng)化和微弱的生物作用等，藏北高寒草原形成了具有原始性和粗骨性等諸多特點(diǎn)的高山草原土（董玉祥，2001），而這些土壤是在疏松的殘坡積物、洪積物、沖洪積物、湖積物和冰積物等沉積物基礎(chǔ)上形成的，含沙量比較豐富，物理性沙礫含量高達(dá) 70.44%（董玉祥，2001）。本研究結(jié)果也表明，SiO2是藏北退化高寒草原土壤的主要化學(xué)組成成分，且土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間的土壤顆粒占比高達(dá)51%。因此，在藏北特殊的高寒自然條件下，土壤礦物風(fēng)化程度低、粗骨性強(qiáng)、石礫含量高（范宇等，2006）。

圖3 土壤細(xì)菌和真菌α多樣性差異比較Fig. 3 Differences in the alpha diversity of soil bacterial and fungal communities

圖4 土壤細(xì)菌（A）和真菌（B）群落在門分類級別上的相對豐度差異比較Fig. 4 Differences in the relative abundance of soil bacterial (Subgraph A) and fungal (Subgraph B) community proportions at the phylum level

相關(guān)研究表明，青藏高原高寒草原土壤細(xì)菌的數(shù)量顯著高于真菌（彭岳林等，2007）；同時，土壤細(xì)菌的多樣性也顯著高于真菌（牛磊等，2015）。本研究結(jié)果表明，藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌的多樣性、豐富度和相對豐度均顯著高于真菌。細(xì)菌的α多樣性顯著高于真菌的主要原因可能是由于細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多的微生物種類（Wang et al.，2016），而真菌更易受到植物有機(jī)質(zhì)輸入的影響（Wang et al.，2018a；Delgado-Baquerizo et al.，2018），且藏北退化高寒草原的植被稀少、植被生產(chǎn)力低下，植物有機(jī)質(zhì)輸入量明顯偏低。因此，土壤真菌的多樣性顯著低于細(xì)菌。細(xì)菌的α多樣性顯著高于真菌的第二個原因可能是在輕度退化草地中，一定程度的土壤風(fēng)化導(dǎo)致土壤生態(tài)微環(huán)境發(fā)生一定程度的改變，進(jìn)而促進(jìn)土壤細(xì)菌的繁殖和活動，從而使土壤細(xì)菌數(shù)量明顯上升（彭岳林等，2007）。一般情況下，植被的種類和豐富度越高，土壤微生物的多樣性也越高（Wang et al.，2015，2018a）。但是，由于嚴(yán)酷的水熱條件、強(qiáng)烈的風(fēng)化、過度放牧等諸多因素的綜合作用，藏北高寒草原退化程度較嚴(yán)重，導(dǎo)致植被較單一。所以，藏北退化高寒草原土壤微生物的多樣性明顯低于其他植被類型的（Wang et al.，2018a，2018b）。同時，藏北高寒草原的低降雨量和高蒸發(fā)量等獨(dú)特特點(diǎn)也是導(dǎo)致其土壤微生物多樣性明顯偏低的主因之一，因?yàn)楦珊祵?dǎo)致土壤微生物的多樣性指數(shù)顯著降低（Guenet et al.，2012；Maestre et al.，2015）。此外，真菌/細(xì)菌比是評價土壤肥力和健康程度的重要指標(biāo)之一（Wang et al.，2016；Kumar et al.，2017），且土壤真菌/細(xì)菌比越高代表土壤肥力越高、土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定程度也越高（de Vries et al.，2006）。本研究結(jié)果顯示，真菌的多樣性、豐富度和相對豐度均顯著小于細(xì)菌。通過對細(xì)菌和真菌多樣性、豐富度和相對豐度進(jìn)行計(jì)算，得出真菌/細(xì)菌比僅分別為0.725、0.260和0.258，比值偏低。這表明，藏北高寒草原土壤肥力已比較低下，且生態(tài)系統(tǒng)已退化，而干旱的環(huán)境條件也是造成真菌細(xì)菌比低下的重要因素之一（Guenet et al.，2012），且真菌比細(xì)菌對干旱更為敏感（Gordon et al.，2008）。

放線菌門和酸桿菌門是高寒區(qū)域土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢門類，如北極苔原永久凍土（Wilhelm et al.，2011）、南極 Lake Zub附近土壤（Shivaji et al.，2004）、加拿大高緯度北極苔原（Neufeld et al.，2004）、阿爾卑斯山地苔原（Zinger et al.，2009）、青藏高原草地（陳偉等，2011）和青藏高原的Chaka湖、Athalassohaline湖（Jiang et al.，2006）以及其他20個湖泊（Xiong et al.，2012）。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，且與其他類型的陸地生態(tài)系統(tǒng)相類似（Barnard et al.，2013）。此外，部分研究結(jié)果顯示：放線菌門的相對豐度在干旱地區(qū)相對較高（Maestre et al.，2015；Wang et al.，2015），而本研究中，放線菌門是土壤細(xì)菌群落相對豐度最高的，這也印證了藏北高寒草原的退化。

土壤真菌群落的優(yōu)勢門類主要為子囊菌門及擔(dān)子菌門（Maestre et al.，2015；Ren et al.，2018）。在高寒區(qū)域的相關(guān)研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，如科羅拉多高山苔原（Schadt et al.，2003），而本研究結(jié)果也得到與之一致的結(jié)論。這表明藏北高寒草原的微生物組成與其他類型的生態(tài)系統(tǒng)具有很大的相似性。因此，若加以環(huán)境保護(hù)與生態(tài)恢復(fù)，藏北高寒草原有望形成良好循環(huán)的生態(tài)系統(tǒng)，若再任之持續(xù)退化，一旦植被與土壤微生物之間的互作反饋關(guān)系被徹底破壞，很可能形成不可逆的生態(tài)破壞。

4 結(jié)論

（1）藏北退化高寒草原土壤化學(xué)成分組成以SiO2為主，占比為63.5%。土壤顆粒粒徑分布介于10～0.1 mm之間，其中介于5～1 mm之間土壤顆粒占比為51%。

（2）細(xì)菌多樣性、豐富度和相對豐度均顯著高于真菌。放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是藏北退化高寒草原土壤細(xì)菌群落的優(yōu)勢門類。

（3）土壤真菌群落的優(yōu)勢門類主要為子囊菌門、其他類和擔(dān)子菌門。

（4）通過對細(xì)菌和真菌多樣性、豐富度和相對豐度進(jìn)行計(jì)算，得出真菌/細(xì)菌比僅分別為 0.725、0.260和0.258，這說明藏北高寒草原土壤肥力已比較低下，且生態(tài)系統(tǒng)也已呈退化趨勢。