薛冬，黃向東，宋根娣，楊瑞先，王慧敏，羅秋玲

洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471023

磷是植物生長發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但土壤中95%以上的磷是難以被植物吸收利用的難溶性磷（Pérez et al．，2007）。通過施肥進入土壤的磷大部分與鈣、鐵、鋁等金屬陽離子相結(jié)合形成難溶性磷酸鹽而在土壤中積累，容易造成磷礦資源浪費以及土壤板結(jié)、環(huán)境污染等生態(tài)環(huán)境問題（李海云等，2015）。溶磷微生物能夠?qū)⑼寥乐须y溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的形態(tài)，提高磷肥利用率，減少環(huán)境污染，被認為是安全、高效活化土壤難溶磷的生物措施（Sharma et a1.，2013）。溶磷微生物在土壤中存活及其溶磷能力易受植物種類和根際土壤環(huán)境等因素影響，因此，從特定植物根際環(huán)境篩選獲得與植物親和性好、易于在根際定殖的高效溶磷微生物，是當前亟待解決的科學(xué)問題。

迄今為止，從植物根際土壤篩選得到的溶磷微生物主要包括細菌、真菌和放線菌，并且溶磷真菌的數(shù)量和種類遠少于溶磷細菌，但其溶磷能力普遍高于溶磷細菌，并具有較強的溶磷遺傳穩(wěn)定性（趙小蓉等，2002；王光華等，2003；于群英等，2012）。目前，已研究報道的溶解難溶無機磷能力較強的真菌主要有曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium），其中，拜萊青霉（Penicillium bilaii）能顯著提高土壤有效磷含量，促進多種作物產(chǎn)量的提高，是國際上普遍認可的溶磷效果非常好的溶磷真菌，應(yīng)用該菌制成的溶磷微生物肥料已在加拿大被商業(yè)化生產(chǎn)（王光華等，2003；Elias et al.，2016）。國內(nèi)主要應(yīng)用巨大芽孢桿菌（Bacillus megatarium）生產(chǎn)溶磷微生物肥料（史發(fā)超等，2014）。因此，不斷挖掘高效溶磷真菌菌種資源具有重要意義和應(yīng)用前景。

牡丹（Paeonia suffruticosa）屬于毛茛科芍藥屬落葉小灌木，素有“國色天香”、“花中之王”之美譽，隨著牡丹產(chǎn)業(yè)由觀賞、藥用拓展至食用、保健等多個領(lǐng)域，其種植面積逐年增加。施肥是非常重要的牡丹栽培管理措施，為使牡丹花大色艷和高產(chǎn)，過量施用無機磷肥已成為普遍現(xiàn)象，這造成牡丹園土壤理化性狀及結(jié)構(gòu)惡化、微生物種群結(jié)構(gòu)失衡、病害嚴重（Xue et al.，2014；Huang et al.，2014）。然而，有關(guān)牡丹根際土壤溶磷微生物的研究鮮見報道。本研究從牡丹根際土壤中篩選溶磷效果較好的溶磷真菌，研究確定其對不同難溶磷的溶磷效果及其對牡丹生長的影響，旨在為牡丹高效生物肥料的研制提供優(yōu)良菌種資源以及為維持牡丹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·4H2O 0.036 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，瓊脂 18.0 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.0～7.5。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

1.2 根際土壤樣品的采集

從河南省洛陽市國家牡丹園選擇品種為洛陽紅的牡丹健康植株，隨機挖出5株，抖落根系外圍土，再用毛刷將粘在根上的根際土壤收集到無菌塑料袋中混勻，立即保存于4 ℃冰箱中，用于牡丹根際溶磷真菌的篩選。

1.3 溶磷真菌的篩選

稱取10 g根際土壤樣品于250 mL三角瓶中，加90 mL無菌水，180 r·min-1振蕩15 min制備土壤懸液，再用 10倍稀釋法，依次制備 10-2、10-3和 10-4的土壤稀釋液，分別涂布于無機磷固體培養(yǎng)基上，然后置于28 ℃生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取有明顯溶磷圈且培養(yǎng)特征有明顯區(qū)別的菌落進行分離純化，保存。將純化菌株接種于無機磷固體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)4 d，測量菌落的溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d），每個菌株重復(fù)3次。

將純化菌株接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其大量產(chǎn)孢，然后洗入無菌水中，振蕩分散孢子，制備成1×108cfu·mL-1的孢子懸浮液，按照1%的接種量接入到無機磷液體培養(yǎng)基，同時以加入等量的無菌水作為對照，每個處理 3次重復(fù)。于28 ℃、180 r·min-1下振蕩培養(yǎng) 7 d，將培養(yǎng)液于4 ℃、10000 r·min-1下離心 10 min，采用鉬銻抗比色法測定上清液中有效磷含量（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部種植業(yè)管理司，2010）。

根據(jù)菌株在無機磷固體培養(yǎng)基上的D/d值和液體培養(yǎng)基中的溶磷量，篩選出溶磷效果較好的菌株，對其進行進一步研究。

1.4 溶磷菌株的鑒定

將菌株接種于 PDA培養(yǎng)基平板，參照《真菌鑒定手冊》觀察其培養(yǎng)特征，顯微鏡下觀察菌絲有無隔膜、孢子的形狀、顏色及其著生方式等菌體形態(tài)特征（魏景超，1979）。

采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的基因組 DNA，以通用真菌引物 NS1（ 5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′） 和 NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）擴增菌株的18S rDNA序列，測序由上海生工生物工程股份有限公司完成，將所測得序列通過NCBI的Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對，將該菌株序列以及相似性較高序列使用ClustalX 2.1軟件進行完全比對分析，然后采用MEGA 6.06軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株的溶磷遺傳穩(wěn)定性試驗

將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)30次，將每代培養(yǎng)物接種于無機磷液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r·min-1下振蕩培養(yǎng)7 d，測定其有效磷含量，分析菌株溶磷量隨傳代次數(shù)的變化。

1.6 菌株對難溶磷源的溶解能力分析

以無機磷液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將難溶磷源分別設(shè)置為等量的磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉，培養(yǎng)基的其他成分不變，按照 1%的接種量將菌株的孢子懸液接入到含不同難溶磷源的培養(yǎng)基中，同時設(shè)不接菌對照，每個處理3次重復(fù)，28 ℃、180 r·min-1下振蕩培養(yǎng)7 d，分別于第24、48、72、96、120、144、168小時測定培養(yǎng)液中有效磷含量和pH值。

1.7 菌株的土壤溶磷效果及促生效果試驗

供試土壤取自河南省洛陽市國家牡丹園褐土，有機碳 13.2 g·kg-1，全氮 1.26 g·kg-1，有效磷 12.8 mg·kg-1，pH 值 7.40。采用口徑為 16 cm，深為 15 cm的塑料盆缽進行試驗，每盆裝土1 kg。試驗設(shè)置對照處理（不接菌，分別施用磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅、磷礦粉）、接種菌株處理（接菌，分別施用磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅、磷礦粉），每種處理6個重復(fù)。將無菌水制備的菌株孢子懸液（1×108cfu·mL-1）以 10 mL·kg-1的用量均勻施加到土壤中，每種難溶磷源以 1 g·kg-1的用量與其充分混勻。采用沙藏層積和低溫處理洛陽紅牡丹種子，選取生根長度一致的種子種植于盆中，每盆1株，80 d后，測量牡丹株高、葉面積、根長、地上部干重、地下部干重，同時測定土壤有效磷含量（鮑士旦，2000）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

運用Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行處理，圖表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。運用軟件 SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），在0.05顯著性水平下進行LSD差異顯著性檢驗和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷真菌的篩選

經(jīng)過初篩，能在無機磷固體培養(yǎng)基上形成明顯溶磷圈的真菌菌株共 3株（表 1），將菌株編號為PPSF1-3，其中，菌株P(guān)PSF1的溶磷圈D/d>2.0（圖1）。通過無機磷液體培養(yǎng)基復(fù)篩，菌株P(guān)PSF1的溶磷量顯著高于菌株P(guān)PSF2和PPSF3。無論采用無機磷固體培養(yǎng)基還是無機磷液體培養(yǎng)基，菌株P(guān)PSF1均表現(xiàn)出較好溶磷效果，因此，將其作為進一步研究的供試菌株。

表1 牡丹根際溶磷真菌的溶磷能力Table 1 Phosphate solubilization capacity of strains isolated from Paeonia suffruticosa rhizosphere

圖1 菌株P(guān)PSF1在無機磷固體培養(yǎng)基上形成的溶磷圈Fig. 1 Soluble phosphorus halo generated by strain PPSF1 in inorganic phosphate solid medium

圖2 菌株P(guān)PSF1在PDA 培養(yǎng)基上的菌落（a）、菌絲（b）、分生孢子頭（c）及分生孢子（d）形態(tài)Fig. 2 Morphologies of the colony (a), mycelium (b), conidial head (c), and conidiophore (d) of strain PPSF1 on PDA medium

2.2 菌株的分類鑒定

菌株P(guān)PSF1在PDA固體培養(yǎng)基上的形態(tài)特征見圖2。該菌生長迅速，菌落不透明，正面呈黑色，邊緣有白色絨狀菌絲，反面有放射性凹溝。菌絲多細胞有隔膜，分生孢子梗頂端膨大形成球形頂囊，表面以放射狀生出小梗，分生孢子為球形，呈褐黑色。根據(jù)以上特征，初步確定該菌株為曲霉屬（Aspergillus）的黑曲霉（Aspergillus niger）。

菌株 PPSF1的 18S rDNA序列經(jīng)測定長度為1300 bp，提交于GenBank數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為MG890328。在NCBI上通過Blast同源性比對分析，以同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株P(guān)PSF1與黑曲霉（Aspergillus niger）的同源性達到100%，處于發(fā)育樹的同一分支，親緣關(guān)系最為接近。結(jié)合菌株的形態(tài)特征，進一步確定菌株P(guān)PSF1為黑曲霉（Aspergillus niger）。

圖3 基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建菌株P(guān)PSF1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain PPSF1 constructed based on the homology of 18S rDNA sequences

2.3 菌株的溶磷遺傳穩(wěn)定性

將菌株P(guān)PSF1傳代培養(yǎng)30次，隨傳代次數(shù)的增加，其溶磷量未發(fā)生顯著變化（圖4），基本穩(wěn)定在(711.2±22.8) mg·L-1范圍內(nèi)，表明菌株 PPSF1的溶磷能力具有較好的遺傳穩(wěn)定性，此特性有助于該菌株的后續(xù)深入研究及開發(fā)應(yīng)用。

圖4 菌株P(guān)PSF1的溶磷遺傳穩(wěn)定性Fig. 4 Genetic stability of phosphate solubilizing strain PPSF1

2.4 菌株對不同磷源的溶解效果

由圖5可知，菌株P(guān)PSF1在以磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉為磷源的液體培養(yǎng)基中的溶磷量均隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先逐漸升高而后基本趨于穩(wěn)定的趨勢。以磷酸鈣和磷酸鋅為磷源時，溶磷量在培養(yǎng)的第 96小時達到最高；以磷酸鋁和磷酸鐵為磷源時，溶磷量在培養(yǎng)的第120小時達到最高；以磷礦粉為磷源時，溶磷量在培養(yǎng)的第144小時達到最高。菌株P(guān)SPSF1在不同無機難溶磷源下的最大溶磷量表現(xiàn)為磷酸鈣（720.6 mg·L-1）>磷酸鋅（633.3 mg·L-1）>磷酸鋁（495.7 mg·L-1）>磷酸鐵（386.4 mg·L-1）>磷礦粉（173.9 mg·L-1），表明菌株P(guān)PSF1對磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉均有較強的溶解能力，并且對不同難溶磷源的溶磷特性有較大差異。

圖5 菌株P(guān)PSF1在不同磷源條件下的溶磷量（a）及pH（b）Fig. 5 Phosphate solubilization capacity (a) and pH (b) of PPSF1 under different phosphorus sources

菌株培養(yǎng)液的pH在5種無機難溶磷源下均呈現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。以磷酸鈣和磷酸鋅為磷源時，在培養(yǎng)的第 96小時下降到最低；以磷酸鋁和磷酸鐵為磷源時，在培養(yǎng)的第120小時下降到最低；以磷礦粉為磷源時，在培養(yǎng)的第144小時下降到最低。相關(guān)性分析顯示，在磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉培養(yǎng)液中，菌株溶磷量與pH的相關(guān)系數(shù)分別為-0.953、-0.957、-0.947、-0.962、-0.959，均呈現(xiàn)顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。

2.5 菌株對土壤難溶磷的溶解能力

圖6 菌株P(guān)PSF1對土壤有效磷含量的影響Fig. 6 Effect of strain PPSF1 on soil available phosphate contentn=3

由圖6可知，無論在施用哪種難溶磷源條件下，接種菌株 PPSF1的土壤有效磷含量均顯著高于未接菌對照。接種菌株P(guān)PSF1在施用磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉的土壤中有效磷含量分別比相應(yīng)的未接菌對照提高386.5%、265.3%、175.7%、327.6%和95.7%，菌株P(guān)PSF1對土壤中不同難溶磷源的溶解能力大小為磷酸鈣>磷酸鋅>磷酸鋁>磷酸鐵>磷礦粉，在以磷酸鈣為磷源條件下其溶磷效果最好。

2.6 菌株對牡丹生長指標的影響

在施用磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉條件下，接種菌株P(guān)PSF1對牡丹生長指標的影響見表2。與未接菌對照相比，接種菌株P(guān)PSF1使牡丹株高、葉面積、根長、地上部干重和地下部干重均顯著增加，分別提高了19.8%～40.7%、13.6%～22.7%、29.7%～46.2%、34.5%～58.5%和 41.2%～64.4%。菌株P(guān)PSF1在不同難溶磷源條件下對牡丹生長的促進效果表現(xiàn)為磷酸鈣>磷酸鋅>磷酸鋁>磷酸鐵>磷礦粉，在以磷酸鈣為磷源條件下對牡丹生長的促進效果最好，使牡丹的株高、葉面積、根長、地上部干重和地下部干重分別增加40.7%、22.7%、46.2%、58.5%和64.4%。

3 討論

牡丹根際溶磷真菌相對較少，僅分離到3株能在無機磷固體培養(yǎng)基上形成明顯溶磷圈的真菌菌株，溶磷效果較好的菌株 PPSF1被鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger），目前已有從小麥（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、花生（Arachis hypogaea）、白菜（Brassica pekinensis）、西紅柿（Lycopersicon esculentum）、類蘆（Neyraudia reynaudiana）等植物根際土壤分離到具有溶磷能力的黑曲霉的研究（馮宏等，2010；劉文干等，2012；Lietal.，2015；Tallapragada，2015；Xiao et al.，2015；楊順等，2018）。然而，已報道的黑曲霉的溶磷能力有較大差異，其對磷酸鈣的溶磷量大都在300～500 mg·L-1。本研究從牡丹根際分離到的菌株P(guān)PSF1對磷酸鈣的最高溶磷量為720.6 mg·L-1?？赡苡捎诤谇狗蛛x地覆蓋植物不同，不同植物根系分泌物及根部脫落物長期為其提供的生長環(huán)境及營養(yǎng)物質(zhì)的差異，導(dǎo)致同種溶磷菌因來自不同環(huán)境而出現(xiàn)定殖能力及溶磷能力的差異（Dassen et al.，2017；丁晶等，2017；黃藝等，2018）。

液體培養(yǎng)試驗及盆栽試驗均表明，溶磷真菌PPSF1對磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉等不同無機難溶磷源均具有較強溶解能力，表明該菌應(yīng)用范圍很廣，在含有多種難溶態(tài)磷源的土壤中均能發(fā)揮溶磷作用。本研究發(fā)現(xiàn)，溶磷真菌PPSF1對不同難溶態(tài)磷源的溶解特性有較大差異，可能由于不同難溶態(tài)磷源的結(jié)構(gòu)和成分差異較大，導(dǎo)致溶磷微生物對其溶解能力顯著不同。

劉文干等（2012）從花生根際篩選到的溶磷菌黑曲霉（Aspergillus niger）B1-A，在不同接種量下，對磷酸鐵和磷酸鋁的溶磷量與培養(yǎng)液pH呈極顯著負相關(guān)。喬志偉等（2013）從石灰性土壤分離到的黑曲霉（Aspergillus niger）Z60，在磷酸鐵培養(yǎng)液中的有效磷含量與培養(yǎng)液pH呈顯著負相關(guān)，而在磷酸鋁培養(yǎng)液中的有效磷含量與 pH相關(guān)性不顯著。馮宏等（2010）從類蘆根際土壤分離到的黑曲霉（Aspergillus niger）FP1，在磷酸鈣、磷酸鋁和磷酸鐵培養(yǎng)液中的溶磷量與培養(yǎng)液的pH值均無顯著相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株P(guān)PSF1在磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉培養(yǎng)液中，菌株溶磷量與pH均呈現(xiàn)顯著負相關(guān)關(guān)系。這些結(jié)果表明，溶磷菌的溶磷量與培養(yǎng)液pH的關(guān)系比較復(fù)雜，即使是同種溶磷菌，也可能受菌株不同株型、不同種類難溶性磷酸鹽和不同種類碳氮源的影響。

表2 菌株P(guān)PSF1對牡丹生長的影響Table 2 Effect of strain PPSF1 on the growth of Paeonia suffruticosa

有關(guān)溶磷真菌對植物促生效應(yīng)的研究已有報道。Singh et al.（2011）的研究發(fā)現(xiàn)，施加溶磷真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）使小麥和玉米植株的地上部生物量和地下生物量相對于對照均有顯著增加。Xiao et al.（2009）研究表明，土壤中施加溶磷真菌Penicillium expansumHB-1能顯著增加小麥植株的莖與根的干重。史發(fā)超等（2014）報道溶磷真菌斜臥青霉（Penicillium decumbens）P83對玉米生長具有顯著作用，使玉米植株鮮重提高9.5%～89.2%、干重增加35%～231%。本研究顯示，施加Aspergillus nigerPPSF1使牡丹的株高、葉面積、根長、地上部干重和地下部干重均顯著高于未接菌對照。眾所周知，植物體內(nèi)多種生理生化過程都需要磷的參與，磷促進細胞分裂，促使植物生長發(fā)育。牡丹生長指標的改善很可能由于該溶磷真菌能將土壤中的難溶態(tài)磷溶解為能被牡丹吸收利用的有效態(tài)磷所致（Reyes et al.，2002）。此外，溶磷真菌通過向根際分泌植物生長素也可促使牡丹生長（代金霞等，2017）。

4 結(jié)論

（1）從牡丹根際土壤分離到一株具有較強溶磷能力的真菌菌株 PPSF1，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和 18S rDNA序列分析將其鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。

（2）菌株P(guān)PSF1對磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉均具有較強溶解能力，其對不同磷源的溶磷量表現(xiàn)為磷酸鈣>磷酸鋅>磷酸鋁>磷酸鐵>磷礦粉，在 5種難溶磷源培養(yǎng)液中的溶磷量均與pH呈現(xiàn)顯著負相關(guān)。

（3）菌株P(guān)PSF1在含有磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷酸鋅和磷礦粉的土壤中溶磷效果顯著，使牡丹的株高、葉面積、根長、地上部干重和地下部干重均顯著增加，有望成為高效生物磷肥的優(yōu)良菌種資源。