李建輝，劉麗麗

(浙江省衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江衢州 324000；衢州學(xué)院化學(xué)與材料學(xué)院，浙江衢州 324000)

王蕾

(國家林業(yè)局林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100010)

榧屬(Torreya)植物隸屬于紅豆杉科(Taxaceae)，共有7種2變種，我國有5種2變種，包括榧樹(T.grandis)、長葉榧(T.jackii)、巴山榧(T.fargesii)、四川榧(T.parvifolia)、云南榧(T.fargesiivar.yunnanensis)、九龍山榧(T.grandisvar.jiulongshanensis)和日本榧(T.nucifera)，其中日本榧為引進(jìn)栽培種，榧樹、長葉榧、巴山榧、四川榧、九龍山榧為我國亞熱帶地區(qū)的特有種，但九龍山榧植株數(shù)量極為有限，四川榧則是近年來發(fā)表的新種[1]。榧屬植物是一類古老珍稀的孑遺植物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)研究價(jià)值，我國榧屬所有種類均被列為國家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[2]，且大部分被收錄于IUCN瀕危物種紅色名錄[3]和《中國物種紅色名錄》[4]，目前亟需制定合理有效的保護(hù)策略。

微衛(wèi)星序列(simple sequence repeat，SSR)廣泛分布于真核生物的核基因組DNA和葉綠體基因組DNA(chloroplast genome DNA，cpDNA)中，由于其具有共顯性、分布廣泛、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，使得SSR標(biāo)記成為遺傳學(xué)分析中極為有用的分子工具[5～7]。另一方面，與核基因組 DNA的SSR相比，葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記(chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)又兼有葉綠體基因組單親遺傳、分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、相對(duì)保守等特點(diǎn)，因而近年來發(fā)展很快，現(xiàn)已成為一種新型高效的分子標(biāo)記技術(shù)并廣泛應(yīng)用于物種鑒定以及種群和個(gè)體水平的遺傳學(xué)分析[8～10]。

為此，本研究選擇我國亞熱帶地區(qū)榧屬植物的3個(gè)代表性物種即榧樹、長葉榧和巴山榧為對(duì)象，對(duì)長葉榧和榧樹進(jìn)行葉綠體全基因組序列的測定，再與已公布的的巴山榧進(jìn)行比較，同時(shí)應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)三者的葉綠體微衛(wèi)星分布特征和規(guī)律進(jìn)行全面分析，以獲得更多榧屬植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)并為開發(fā)榧屬植物葉綠體通用微衛(wèi)星引物提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的長葉榧樣品采自浙江省桐廬縣白云源森林公園，榧樹樣品采自浙江省杭州植物園。在長葉榧和榧樹的植株上分別采集健康幼嫩葉片，擦拭干凈后裝入放有足量干冰的低溫貯藏箱中送上海翰宇生物科技有限公司在Illumina Hiseq 2500中進(jìn)行葉綠體基因組測序。

1.2 方法

將長葉榧和榧樹的葉綠體基因組測序結(jié)果提交至NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫(https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲得基因組入庫序列號(hào)。同時(shí)，在GenBank 中下載已公布的巴山榧葉綠體基因組全序列測序結(jié)果(入庫序列號(hào)為KT027377)。采用MIcroSAtellite (MISA)軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索SSR重復(fù)序列，設(shè)定單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復(fù)分別為10、5、4、4、3和 3次[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpSSR分布區(qū)域特征

長葉榧和榧樹的葉綠體基因組測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中入庫序列號(hào)分別為KX902234、KY369757。從測序結(jié)果來看，3種榧屬植物葉綠體基因組均為環(huán)狀雙鏈DNA，全序列總大小以巴山榧最大，榧樹次之，長葉榧最小，依次為137075、136949、136720bp。在巴山榧、榧樹、長葉榧中，利用MISA軟件分別搜索到34、42、36個(gè)重復(fù)序列，總大小分別為407、522、463bp，各占 cpDNA 全序列的 0.30%、0.38%、0.34%。3個(gè)物種葉綠體基因組上cpSSR分布范圍都較廣，其中巴山榧的cpSSR分布于4061bp～132480bp之間，榧樹的cpSSR分布于8762bp～132419bp之間，長葉榧的cpSSR分布于4051bp～114413bp之間，但這種分布并不平衡，有集中區(qū)與稀疏區(qū)之分。從圖1可以看出，3種榧屬植物的 cpSSR 主要集中分布在20～120kb區(qū)域，這個(gè)區(qū)域分布的cpSSR占微衛(wèi)星總數(shù)的90%以上，而0～20kb和120～140kb的區(qū)域分布的數(shù)量較少。

圖1 cpSSR在3種榧屬植物葉綠體DNA中的分布

2.2 cpSSR不同堿基重復(fù)類型的比較

從3種榧屬植物cpSSR不同堿基重復(fù)類型的分布特征來看，在搜索到的cpSSR中，3種榧屬植物cpSSR重復(fù)序列主要由單堿基和四堿基微衛(wèi)星構(gòu)成，其他堿基重復(fù)的微衛(wèi)星較少(表1)。在巴山榧cpSSR中，單堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的58.82%、四堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的23.53%；在長葉榧cpSSR中，單堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的63.89%、四堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的22.22%；在榧樹cpSSR中，單堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的57.14%、四堿基微衛(wèi)星占總數(shù)的23.81%。

表1 3種榧屬植物葉綠體DNA中cpSSR不同堿基重復(fù)類型比較

在單堿基微衛(wèi)星重復(fù)中，3種榧屬植物均以A和T的單堿基重復(fù)為主，C的重復(fù)極少，而且都沒有出現(xiàn)G的重復(fù)。在巴山榧cpSSR中，A和T的單堿基重復(fù)占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的100%；在長葉榧cpSSR中，A和T的單堿基重復(fù)占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的95.65%；在榧樹cpSSR中，A和T的單堿基重復(fù)占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的95.83%。

此外，在二堿基微衛(wèi)星的堿基分布中，3種榧屬植物均以AT重復(fù)為主，且只有在榧樹中出現(xiàn)TA重復(fù)；三堿基微衛(wèi)星均為ATT重復(fù)；四堿基微衛(wèi)星不同堿基重復(fù)類型較多，但每種類型的數(shù)量相對(duì)較少，整體呈現(xiàn)出相對(duì)分散的格局；五堿基微衛(wèi)星僅在榧樹中出現(xiàn)1種類型。

2.3 cpSSR單堿基不同重復(fù)次數(shù)的分布

從3種榧屬植物cpDNA中單堿基重復(fù)次數(shù)的總體分布情況來看(表2)，單堿基微衛(wèi)星重復(fù)以(A)n和(T)n為主，其中(A)n微衛(wèi)星重復(fù)多于(T)n，且堿基重復(fù)數(shù)主要集中在10個(gè)至14個(gè)，堿基重復(fù)數(shù)在15個(gè)以上的相對(duì)較少。在巴山榧中，微衛(wèi)星(A)n重復(fù)以10次最多，共6個(gè)；微衛(wèi)星(T)n重復(fù)以11次最多，共3個(gè)。在長葉榧中，微衛(wèi)星(A)n重復(fù)以10次和11次最多，均為5個(gè)；微衛(wèi)星(T)n重復(fù)以10次最多，共2個(gè)。在榧樹中，微衛(wèi)星(A)n重復(fù)以10次最多，共6個(gè)；微衛(wèi)星(T)n重復(fù)以10次最多，共3個(gè)。

表2 3種榧屬植物葉綠體DNA中cpSSR單堿基不同重復(fù)次數(shù)比較

3 討論

明確 cpSSR在葉綠體基因組中的分布規(guī)律是開發(fā)cpSSR分子標(biāo)記的前提。為獲取更多榧屬植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)，本研究對(duì)長葉榧和榧樹進(jìn)行了葉綠體全基因組序列的測定，并已登記于GenBank 數(shù)據(jù)庫中，再加上先前已公布的巴山榧葉綠體基因組全序列信息，可為后續(xù)開發(fā)榧屬植物cpSSR通用引物奠定重要基礎(chǔ)。

從本研究結(jié)果來看，3種榧屬植物葉綠體基因組均為環(huán)狀雙鏈DNA，總長度在136720 ～137075bp之間。3種榧屬植物的葉綠體微衛(wèi)星以榧樹中最多，為42個(gè)，其次為長葉榧(36個(gè))，巴山榧中最少(34個(gè))。3種榧屬植物葉綠體微衛(wèi)星均呈現(xiàn)出單堿基重復(fù)較多、3核苷酸重復(fù)數(shù)較少的特點(diǎn)，且單堿基重復(fù)主要以(A)n和(T)n為主，這一分布特征在其他科屬植物的cpDNA中也同樣存在[12～14]。此外，3種榧屬植物的cpSSR中均不存在單核苷酸G的微衛(wèi)星標(biāo)記，這可能與榧屬植物本身的生物學(xué)特性有關(guān)。

在微衛(wèi)星的重復(fù)基元類型和重復(fù)次數(shù)方面，3種榧屬植物均呈現(xiàn)出重復(fù)基元類型不多、重復(fù)次數(shù)較少且以單堿基重復(fù)為主的特點(diǎn)，這可能與葉綠體基因組本身的特點(diǎn)和進(jìn)化方向有關(guān)。與核基因組相比，葉綠體基因組相對(duì)較小，進(jìn)化速率僅為核基因組的1/5，平均每年每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)化速率為(0.2～1.0)×10-9[15]。同時(shí)葉綠體基因組呈單親遺傳，其遺傳物質(zhì)在由親代向子代傳遞過程中不涉及基因重組，也不受選擇壓力，因而序列結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，保守性較強(qiáng)，從而使得葉綠體SSR的變異類型要少于核基因SSR[16,17]。

已有的研究表明，從一個(gè)物種基因組中分離出來的SSR可用于同屬中的其他物種的遺傳學(xué)分析，如此可極大降低SSR的開發(fā)成本，并為其廣泛應(yīng)用創(chuàng)造有利條件[18～20]。Powell等[21]在松屬(Pinus)不同植物中篩選得到一批葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記，并成功用于松科(Pinaceae)其他植物的種質(zhì)資源研究。Weising等[22]利用 cpSSR側(cè)翼序列的保守性開發(fā)了10對(duì)可用于不同物種分析的cpSSR通用引物；Grivet等[23]通過對(duì)煙草(Nicotianatabacum)的研究開發(fā)了一批通用的cpSSR引物。Cheng等[24]從不同物種的22對(duì)cpSSR引物中篩選得到9對(duì)可用于柑橘(Citrusreticulata)親緣關(guān)系分析的通用引物。因此，通過對(duì)3種榧屬植物cpSSR分布特點(diǎn)和規(guī)律的研究，可為后續(xù)榧屬甚至紅豆杉科其他屬植物通用cpSSR分子標(biāo)記的開發(fā)提供重要信息。