吳藹林，韓彬，彭佳媛，朱彥鋒，彭曉莉，歐愚，余小平

乳腺癌是一種嚴重危害女性身心健康的惡性腫瘤，人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽性乳腺癌占乳腺腫瘤的25%～30%［1］；HER-2陽性乳腺癌具有浸潤性強，對化療藥物和內(nèi)分泌治療藥物不敏感、腫瘤血管增生增多等特點［2-3］。研究顯示，HER-2高表達與腫瘤惡性表型和耐藥密切相關(guān)［4］。筆者所在研究團隊研究亦顯示，黑米花青素（BRACs）混合物及其有效活性單體飛燕草素（Dp）有抗HER-2陽性乳腺癌效應(yīng)，BRACs能調(diào)節(jié)HER-2受體的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性，阻斷HER-2受體介導(dǎo)的下游信號通路激活，抑制HER-2陽性乳腺癌的血管生成和轉(zhuǎn)移，還能阻斷核因子（nuclear factor kappa beta，NF-κB）信號通路，進而誘導(dǎo)HER-2陽性乳腺癌細胞凋亡；Dp既能誘導(dǎo)HER-2陽性乳腺癌細胞MDA-MB-453凋亡，又能通過抑制AKT/mTOR通路來誘導(dǎo)細胞自噬［5］。然而，有關(guān)其誘導(dǎo)HER-2陽性乳腺癌細胞凋亡的分子機制尚不明確。本研究旨在探討Dp是否通過阻斷NF-κB信號通路來誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗HER-2陽性乳腺癌增殖作用。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 人乳腺癌細胞MDA-MB-453和BT-474（HER-2陽性，中國科學(xué)院上海細胞庫），Dp（43725，美國Sigma公司，純度≥95%），胎牛血清（#10099-141，美國Gibco公司），0.25%Tripsin-EDTA、L-15細胞培養(yǎng)基、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基（SH30042.01、SH30525.01、SH30809.01，美國Hyclon公司），CCK-8（CK04，日本同仁化學(xué)研究所），T25培養(yǎng)瓶、六孔板（美國Thermo公司），Western及IP細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒（#P0013、ST506、#P0010，中國碧云天生物技術(shù)有限公司），TUNEL檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒（KGA7072、KGA215中國凱基生物技術(shù)股份有限公司），HE染色試劑盒（#D006，中國南京建成生物工程研究所），PKCα、IKKα、IKKβ、p-IKKα/β、IκBα 抗體（#59754、#11930、#8943、#2697、#4814，美國Cell Signaling Technology公司），p-PKCα、p-IκBα、p-NF-κB/p65抗體（ab23513、ab12134、ab28856，英國Abcam公司），β-actin抗體（TA-09，中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 主要儀器 倒置熒光相差顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，臺式高速冷凍離心機為美國Thermo公司產(chǎn)品，酶標儀為美國BioTek公司產(chǎn)品，流式細胞儀為美國BD Biosciences公司產(chǎn)品，垂直電泳儀、Trans-Blot TurboTMTransfer System、化學(xué)發(fā)光成像儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)MDA-MB-453細胞（HER-2型，ER－、PR－、HER-2＋）用含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；BT-474細胞（Luminal B型，ER＋、PR＋、HER-2＋）用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，選對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 CCK-8檢測不同濃度的Dp對細胞存活率的影響 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，密度為8×104個/mL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，貼壁后加入10、20、40、80及160 μmol/L 5個不同濃度的Dp，每個濃度3個復(fù)孔，DMSO作為溶劑對照（Control）。Dp作用48 h后，加入CCK-8，作用2 h，于酶標儀450 nm波長下檢測光密度（OD）值，計算細胞存活率（cell viability）和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.3 HE染色觀察Dp對細胞形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期細胞接種于細胞爬片，密度為2×105個/mL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，貼壁后加入不同濃度的Dp（根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果確定后續(xù)Dp實驗濃度為20、40、80 μmol/L），DMSO作為溶劑對照（Control），藥物作用48 h，4%多聚甲醛固定20 min，根據(jù)HE染色試劑盒說明書進行染色，鏡檢或封片觀察。

1.3.4 PI單染法檢測細胞周期 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后接種到6孔板，密度為2×105個細胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，貼壁后加入不同濃度Dp（20、40、80 μmol/L），DMSO作為溶劑對照（Control），藥物作用48 h，收集細胞，用體積分數(shù)為70%的預(yù)冷乙醇4℃固定過夜，根據(jù)細胞周期檢測試劑盒（凱基）說明書進行操作，4℃染色避光30 min，用BD公司FACScan流式細胞儀進行檢測并計算各周期細胞比例，采用GraphPad Prism軟件繪制統(tǒng)計圖。

1.3.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞胰酶消化后接種到6孔板，細胞密度為2×105個細胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，貼壁后加入不同濃度Dp（20、40、80 μmol/L），DMSO作為溶劑對照（Control），藥物作用48 h。用4%多聚甲醛固定細胞，按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作，熒光顯微鏡觀察拍照并計算凋亡率（Apoptosisrate），采用GraphPad Prism軟件繪制統(tǒng)計圖。

1.3.6 Weston Blot檢測NF-κB信號通路相關(guān)分子表達水平 不同濃度Dp（20、40、80 μmol/L）處理細胞48 h后，棄培養(yǎng)液，將各組細胞用預(yù)冷的PBS洗2次。各組培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含10%PMSF的western及IP細胞裂解液200 μL，冰上裂解10～30 min。充分裂解后，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液后以BCA法測定蛋白濃度。將定量后的蛋白與4×loading buffer按比例混合，高溫變性5 min，進行SDS-PAGE電泳（80 V 30 min，120 V 1 h），轉(zhuǎn)膜（200 mA，2 h），用5%BSA 37℃封閉1 h，加入p-IκBα、IκBα、p-IKKα/β、IKKα、IKKβ、p-PKCα、PKCα、p-NF-κB/p65蛋白抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST清洗（3×10 min），加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，37℃孵育2 h，TBST清洗（3×10 min），加入ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色曝光，采用Image J進行灰度分析，運用GraphPad Prism軟件分析蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間進行單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dp對HER-2陽性乳腺癌細胞存活率和細胞形態(tài)的影響 （1）存活率。根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果擬合繪制細胞存活率曲線（圖1），Dp能有效抑制MDAMB-453和BT-474乳腺癌細胞增殖，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，其中對BT-474乳腺癌細胞增殖影響呈劑量依賴性，見圖1A、B。Dp對MB-453和BT-474乳腺癌細胞IC50分別為41.02和60.97 μmol/L，因而后續(xù)研究中Dp的干預(yù)濃度設(shè)定為20、40、80 μmol/L。（2）細胞形態(tài)。Dp處理組部分細胞脫落漂浮，裂解，細胞體積隨Dp濃度增加逐漸減小，見圖1C、D。

Fig.1 Effects of delphinidin on morphology and proliferation of HER-2 positive breast cancer cells圖1 Dp對HER-2陽性乳腺癌細胞形態(tài)學(xué)及增殖的影響

2.2 Dp對HER-2陽性乳腺癌細胞周期的影響MDA-MB-453細胞中，80 μmol/L Dp處理組G2/M期細胞比例高于Control組和20 μmol/L Dp處理組（P＜0.05），見圖2A、C；BT-474細胞中，80 μmol/L Dp處理組G2/M期細胞比例高于Control組、20 μmol/L Dp處理組和40 μmol/L Dp處理組（P＜0.05），見圖2B、D。

2.3 Dp對HER-2陽性乳腺癌細胞凋亡的影響 與Control組相比，Dp處理組MDA-MB-453和BT-474細胞DNA片段顯著增加，凋亡細胞數(shù)量增加，且凋亡細胞數(shù)隨Dp濃度增大而逐漸增多。MDA-MB-453細胞中，40、80 μmol/L Dp處理組凋亡率均高于Control組和20 μmol/L Dp處理組（P＜0.05）。20 μmol/L Dp處理組與Control組相比促細胞凋亡作用無顯著差異；BT-474細胞中，隨藥物濃度升高，各處理組細胞凋亡率依次增加，呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖3。

2.4 Dp對NF-κB信號通路相關(guān)分子表達的影響 與Control組相比，MDA-MB-453和BT-474細胞40和80 μmol/L Dp處理組p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα/β、p-PKCα 表達水平降低，IκBα、IKKα、IKKβ、PKCα表達水平增加，Dp可通過阻斷NF-κB信號通路誘導(dǎo)HER-2陽性乳腺癌細胞凋亡，見圖4。

Fig.2 Effects of delphinidin on cell cycle of HER-2 positive breast cancer cells圖2 Dp對HER-2陽性乳腺癌細胞周期的影響

Fig.3 Delphinidin induced apoptosis of MDA-MB-453 and BT-474 cells圖3 Dp誘導(dǎo)MDA-MB-453和BT-474細胞凋亡

Fig.4 Delphinidin induced HER-2 positive breast cancer cell apoptosis by blocking NF-κB signaling pathway圖4 Dp通過阻斷NF-κB信號通路誘導(dǎo)HER-2陽性乳腺癌細胞凋亡

3 討論

花青素是一類廣泛存在于植物中的天然黃酮類水溶性化合物，主要通過較強的抗氧化特性發(fā)揮健康防護作用［6］，還能通過非氧化途徑發(fā)揮腫瘤防治效應(yīng)[7-8]。Dp是花青素中的主要活性成分，由于Dp在花青素中的豐度較高，活性較強［6,9］，成為花青素單體抗癌研究的重點。Dp能通過多種機制抑制不同的腫瘤細胞增殖。Thiele等［10］證實，Dp能抑制人血管和淋巴內(nèi)皮細胞、HT29結(jié)腸癌細胞、乳腺癌細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，尤其可減少乳腺癌模型的血管生成。Ozbay［11］研究顯示，Dp通過阻斷MAPK通路來抑制雌激素受體（ER）陽性、三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。Im等［12］發(fā)現(xiàn)，ER陽性乳腺癌細胞MCF-7中，Dp可通過阻斷NF-κB和MAPK信號通路，從而抑制PMA誘導(dǎo)的MMP-9的表達。

本研究結(jié)果顯示，Dp能有效抑制MDA-MB-453和BT-474乳腺癌細胞增殖，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，其中對BT-474乳腺癌細胞增殖影響呈劑量依賴性。細胞周期調(diào)控異常是癌細胞的基本特征。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度Dp處理后MDA-MB-453和BT-474細胞均出現(xiàn)G2/M期比例升高，提示Dp能將MDA-MB-453和BT-474細胞阻滯于G2/M期。細胞凋亡不受正?？刂剖菍?dǎo)致癌細胞無限增殖的主要原因［13］，本研究通過TUNEL法檢測細胞凋亡情況，觀察Dp對MDA-MB-453和BT-474細胞的抑制效果。與Control相比，不同濃度Dp處理后，兩種細胞凋亡率均升高，與Thiele等［10］研究相近，表明Dp能介導(dǎo)MDA-MB-453和BT-474細胞凋亡。

NF-κB信號通路在腫瘤細胞的生存中發(fā)揮了重要作用，其持續(xù)活化與腫瘤形成、生長、轉(zhuǎn)移及化療耐藥有關(guān)。靜息狀態(tài)下，NF-κB與кB的抑制劑（IкB）結(jié)合，以非活性狀態(tài)存在。許多胞外刺激因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、脂多糖等化學(xué)或物理性應(yīng)激物（如紫外線等），可通過磷酸化IкB使其降解，解離的NF-кB進入核內(nèi)并暴露核識別位點，從而參與靶基因轉(zhuǎn)錄［14］。體內(nèi)外的實驗研究表明，NF-кB在乳腺癌中異常激活，抑制乳腺癌細胞NF-кB的活性可引起腫瘤細胞的凋亡，從而抑制乳腺癌細胞生長［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control相比，40和80 μmol/L Dp處理后MDA-MB-453、BT-474細胞的p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα/β、p-PKCα表達水平顯著降低，IκBα、IKKα、IKKβ、PKCα表達水平增加，進一步表明Dp可通過抑制IκB-α的降解發(fā)揮抑制NF-κB活化的作用，由此推測Dp的抗腫瘤活性與阻斷NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上所述，Dp通過阻斷NF-κB信號通路來誘導(dǎo)MDA-MB-453和BT-474細胞G2/M期周期阻滯和凋亡，從而發(fā)揮抗增殖作用。為研究Dp抗HER-2陽性乳腺癌的作用機制提供了新的方向。但目前研究大多局限于細胞和動物實驗，后續(xù)有必要進一步開展人群研究和臨床研究。

Fig.3 Delphinidin induced apoptosis of MDA-MB-453 and BT-474 cells圖3 Dp誘導(dǎo)MDA-MB-453和BT-474細胞凋亡