董曉光，許孝飛，馬江波，瞿寶明，扈燕來，張靜，李濤△

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩，其主要的病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性導(dǎo)致多巴胺（Dopamine，DA）含量降低以及Lewy小體的形成［1］。雖然目前PD的確切發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，但有研究表明，引起PD的多種致病因素均可通過氧化應(yīng)激這一共同通路造成神經(jīng)元的損傷［2-3］。因此，減輕多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激成為防治PD的一個(gè)重要策略［4］。

PC12細(xì)胞源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，胞質(zhì)內(nèi)富含多巴胺受體以及合成、分解DA所需的各種酶，能合成、儲(chǔ)存并釋放DA，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征，被廣泛應(yīng)用于DA能神經(jīng)元的研究［5］。6-羥基多巴胺（6-OHDA）是DA能神經(jīng)遞質(zhì)的羥基化衍生物，結(jié)構(gòu)與DA相似。6-OHDA與DA競(jìng)爭(zhēng)攝取位點(diǎn)后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過自身及產(chǎn)生的活性氧（ROS）對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷作用，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡［6］，已被廣泛應(yīng)用于PD動(dòng)物和細(xì)胞模型中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）具有抗氧化損傷及細(xì)胞凋亡的作用，在多種細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入一定濃度的IGF-1可以起到抗氧化損傷作用［7-8］。但是，IGF-1對(duì)6-OHDA處理PC12細(xì)胞引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用尚不明確。本研究以6-OHDA處理PC12細(xì)胞建立PD模型，探討IGF-1對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料PC12細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；6-OHDA購自于美國(guó)Sigma公司；IGF-1購自PeproTech公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自Biosharp；ROS試劑盒購自碧云天生物工程有限公司；Hoechst33342、PI購自Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)濃度篩查 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞置于含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基。將PC12細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分為5個(gè)亞組，分別加入25、50、100、150、200 μmol/L的6-OHDA（溶解于維生素C溶液），對(duì)照組加入等體積維生素C溶液。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性PC12細(xì)胞的單細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，給予25、50、100、150、200 μmol/L 6-OHDA處理后，分別于處理后12、24和48 h加入終濃度為0.5 mg/L的MTT，37℃下繼續(xù)孵育4 h后，小心吸棄孔內(nèi)上清液。每孔內(nèi)加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），室溫下振蕩10 min以終止反應(yīng)并充分溶解甲臜結(jié)晶，Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的光密度（OD）值，每組重復(fù)3次。

1.2.3 IGF-1處理分組及活性檢測(cè) 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取150 μmol/L的6-OHDA濃度作為本實(shí)驗(yàn)的處理濃度及處理后24 h作為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。分為（1）對(duì)照組：加入等體積維生素C溶液。（2）6-OHDA組：給予150 μmol/L的6-OHDA處理。（3）IGF-1+6-OHDA組：給予IGF-1 100 nmol/L預(yù)處理2 h，然后加入150 μmol/L 6-OHDA。將各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。方法同1.2.2。

1.2.4 ROS水平檢測(cè) 各組PC12細(xì)胞以6×105/mL的濃度接種于24孔板，24 h后棄培養(yǎng)基，加入200 μL終濃度為10 μmol/L的無血清2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸酯（DCFH-DA），于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育20 min，棄染液，用無血清培養(yǎng)基洗3遍，加入500 μL培養(yǎng)基，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組PC12細(xì)胞以6×105/mL的密度接種于24孔板內(nèi)，孵育24 h后吸棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細(xì)胞2次，24孔板中加入200 μL終濃度為10 mg/L的Hoechst33342和PI混合工作液，37℃染色15 min，棄染液，PBS洗1遍后，倒置熒光顯微鏡下觀察并照相分析。每組隨機(jī)取5個(gè)視野，應(yīng)用IPP圖像分析軟件分別計(jì)數(shù)每張圖片中PC12細(xì)胞的總數(shù)目及凋亡細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算PC12細(xì)胞凋亡率（細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/PC12細(xì)胞總數(shù)目×100%）。每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間均數(shù)比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用 光學(xué)顯微鏡下可見對(duì)照組PC12細(xì)胞均勻分布，胞體呈圓形或橢圓形，形態(tài)規(guī)則，突起長(zhǎng)短不一并相互連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。給予不同濃度的6-OHDA處理后，PC12細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，胞體萎縮，突起變短、斷裂甚至消失，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)斷裂，且這種損傷呈濃度依賴性。選取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA處理12 h后，各實(shí)驗(yàn)亞組PC12細(xì)胞活力變化不明顯；24 h后細(xì)胞活性開始下降，并隨6-OHDA濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低，呈濃度依賴性；48 h后，即使較低濃度的6-OHDA處理，細(xì)胞活力也較對(duì)照組下降明顯，見圖1。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，150 μmol/L 6-OHDA處理24 h后細(xì)胞損傷明顯，以此作為本研究的最佳的實(shí)驗(yàn)濃度和觀察時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組PC12細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA組細(xì)胞活性明顯下降，IGF-1+6-OHDA組細(xì)胞活性則高于6-OHDA組，IGF-1表現(xiàn)出較為顯著的細(xì)胞保護(hù)作用，見圖2。

2.3 PC12細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，6-OHDA組PC12細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度明顯增加，表明6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生了大量ROS。而給予IGF-1預(yù)處理后，IGF-1+6-OHDA組PC12細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度較6-OHDA組顯著減弱，綠色熒光變暗，見圖3A。6-OHDA組綠色熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的（2.29±0.20）倍，而IGF-1+6-OHDA組熒光強(qiáng)度降低為對(duì)照組的（1.31±0.13）倍，見圖3B。

Fig.1 Effects of different concentrations of 6-OHDA on the activity of PC12 cells at different time points圖1 不同濃度6-OHDA處理后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

Fig.2 Effects of IGF-1 on the activity of PC12 cells treated with 6-OHDA圖2 IGF-1對(duì)6-OHDA處理的PC12細(xì)胞活性的影響

Fig.3 Detection results and analysis of ROS of PC12 cells圖3 PC12細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)結(jié)果

2.4PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果 經(jīng)Hoechst33342/PI染色后，對(duì)照組PC12細(xì)胞胞核呈淡藍(lán)色圓形或橢圓形，染色體均勻一致；6-OHDA組PC12細(xì)胞核縮小、亮藍(lán)色的凋亡細(xì)胞及紅色死亡細(xì)胞明顯增多，見圖4A；而給予100 nmol/L IGF-1預(yù)處理2 h，再次給予相同濃度的6-OHDA處理后，PC12細(xì)胞的凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞明顯減少，見圖4B。

Fig.4 Results and analysis of apoptosis of PC12 cells圖4 PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

3.1 PD與氧化應(yīng)激PD作為全球第二大神經(jīng)退行性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性及紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)丟失為病理特征，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為PD主要是基因易感性和環(huán)境因素雙重作用的結(jié)果［9］，而年齡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)代謝紊亂和細(xì)胞凋亡都與PD的發(fā)病密切相關(guān)［10-11］。研究表明，DA合成過程中產(chǎn)生的ROS、低水平的谷胱甘肽以及鐵離子濃度的升高均是導(dǎo)致PD患者黑質(zhì)和紋狀體通路神經(jīng)元死亡的重要因素［12］。另外，DA代謝中產(chǎn)生的醌、過氧化物和其他的ROS也會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。在PD患者腦中的黑質(zhì)致密部發(fā)現(xiàn)有大量的ROS產(chǎn)生，這也提示了氧化應(yīng)激反應(yīng)在PD的損傷中扮演重要的角色［13］。然而目前臨床尚無有效的抗氧化應(yīng)激藥物，減輕氧化應(yīng)激所致的多巴胺能神經(jīng)元損傷成為治療PD的研究熱點(diǎn)。

3.2 6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷 氧化應(yīng)激是指ROS的產(chǎn)生超過了細(xì)胞抗氧化能力的狀態(tài)，可由多種因素引發(fā)，被認(rèn)為是PD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一［14］。氧自由基可以導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用和蛋白質(zhì)氧化，從而破壞細(xì)胞的完整性，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等功能異常，導(dǎo)致過量ROS產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生丙二醛（MDA）、蛋白羰基化和DNA斷裂［15］。6-OHDA通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的氧化反應(yīng)產(chǎn)生ROS等物質(zhì)，直接抑制線粒體呼吸鏈，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而損傷中樞多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體通路發(fā)生退行性變。ROS作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，首先出現(xiàn)在線粒體中，當(dāng)ROS大量累積時(shí)可氧化重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，通過線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致PD的發(fā)生發(fā)展［16］。因此，抑制ROS對(duì)阻斷PD的發(fā)生發(fā)展有重要意義。本研究中發(fā)現(xiàn)，6-OHDA能夠誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量ROS，提示在6-OHDA作用下，PC12細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。細(xì)胞活性檢測(cè)顯示，隨著6-OHDA濃度的增加，PC12細(xì)胞活性下降，呈濃度依賴性，細(xì)胞凋亡數(shù)量也明顯增多，PC12細(xì)胞損傷嚴(yán)重。

3.3 IGF-1對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用IGF-1主要在肝臟合成，是由70個(gè)氨基酸組成的分子質(zhì)量為7 649 ku的多肽，具有內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌三種特性，與其受體（IGF-1R）結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)功能，并參與機(jī)體多種器官功能調(diào)節(jié)［17］。研究表明，IGF-1不僅具有胰島素類似的功能及介導(dǎo)生長(zhǎng)激素的作用，還能通過抑制半胱天冬酶-3（Caspase-3）、Caspase-9等而發(fā)揮抗凋亡作用，抑制神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及肌肉細(xì)胞的凋亡［18］。其在線粒體保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、改善胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝以及抗氧化作用等方面具有許多優(yōu)點(diǎn)。IGF-1對(duì)多巴胺能神經(jīng)元尤其重要，大腦黑質(zhì)中IGF-1 mRNA的濃度比大腦其他部位的總濃度高3倍，并且黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶免疫陽性細(xì)胞中包含IGF-1受體［19］。Ayadi等［20］在6-OHDA紋狀體灌注大鼠PD模型研究中發(fā)現(xiàn)，IGF-1可以通過Ras/ERK1/2和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。IGF-1屬于腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF），與其他大多數(shù)的BDNF不同的是，IGF-1能夠通過轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)穿過血腦屏障。已有研究證明，血液中的IGF-1在腦損傷［21］、脊髓損傷［22］和海馬神經(jīng)生成［23］中發(fā)揮重要的保護(hù)作用，這種特性對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療干預(yù)具有明顯優(yōu)勢(shì)。因此，筆者用外源性IGF-1預(yù)處理，觀察對(duì)6-OHDA介導(dǎo)的PC12細(xì)胞的毒性損傷的保護(hù)作用，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究中發(fā)現(xiàn)，給予100 nmol/L的IGF-1預(yù)處理后，與6-OHDA組比較，IGF-1+6-OHDA組PC12細(xì)胞活力下降減少、ROS水平下降、細(xì)胞凋亡減少，表現(xiàn)出很好的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，一定濃度的IGF-1能夠減少6-OHDA引起的PC12細(xì)胞氧化損傷及凋亡，增加細(xì)胞活性，為防治PD的發(fā)生發(fā)展提供了潛在的策略，但其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。