任媛，蘇新明，陸常玲，李朋，李孟露，康健

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽，110001)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道異質(zhì)性疾病，在其整個(gè)疾病進(jìn)程中大量基因被異常激活，基因表達(dá)水平顯著高于正常人群[1]。組蛋白的共價(jià)修飾與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，其中由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetylases, HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases, HDACs）調(diào)控的乙?；揎椩诨蜣D(zhuǎn)錄激活過程中至關(guān)重要[2]。哮喘致病時(shí)患者體內(nèi)HDACs活性降低，HATs活性升高，且HDACs抑制劑干預(yù)能夠有效緩解哮喘相關(guān)氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)[3-7]。但HDACs家族成員眾多，迄今為止哮喘致病時(shí)各成員在肺組織中的表達(dá)形態(tài)改變?nèi)圆磺宄?。我們的團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用不同亞型HDACs抑制劑（廣譜HDACs抑制劑、HDAC6特異性抑制劑、HDAC8特異性抑制劑）干預(yù)哮喘小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)：盡管不同亞型的HDACs抑制劑均能夠有效緩解哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)，但HDAC8特異性抑制劑的抗炎效果要優(yōu)于其他HDACs抑制劑[8]。同時(shí)，許多學(xué)者認(rèn)為HDAC8在T細(xì)胞增殖分化凋亡以及平滑肌細(xì)胞分化、收縮等病理生理中均發(fā)揮了重要作用[9-11]。因此，本次研究的目的主要是明確哮喘致病時(shí)HDAC8在肺組織中的表達(dá)定位和表達(dá)水平，探討HDAC8與哮喘發(fā)病的關(guān)系。

材料和方法

1 小鼠哮喘模型制備及分組

6～8周SPF級(jí)雌性BALB/C小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001]。隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組和哮喘組，12只/組。于實(shí)驗(yàn)第0、7、14d，哮喘組小鼠予以卵蛋白OVA（20μg）和氫氧化鋁凝膠（2mg）混懸液腹腔注射致敏。末次致敏1周后，應(yīng)用超聲霧化裝置（3ml/min）進(jìn)行OVA（20mg/ml）霧化激發(fā)8周，3次/周，30min/次。正常組均以等量生理鹽水代替OVA處理。

2 HE染色評(píng)估哮喘建模

末次激發(fā)實(shí)驗(yàn)24h后，各組小鼠麻醉處死，取左側(cè)肺組織，固定，包埋，切片（5μm）后行HE染色。石蠟切片脫蠟水化，蘇木素染5～10min，自來水沖洗5min，鹽酸酒精分化3s，自來水洗返藍(lán)30min，伊紅復(fù)染1～2min，自來水洗去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察哮喘組小鼠氣道肺組織炎癥浸潤水平。

3 免疫組織化學(xué)染色觀察HDAC8在肺組織中的表達(dá)分布

行肺組織HDAC8免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟水化，3% H2O2室溫孵育5min，PBS 洗3次，5min/次；微波爐抗原修復(fù)24min，6min/次，PBS 洗3次，5min/次；10% BSA室溫孵育30min，HDAC8多克隆抗體（1∶500，美國，Novus）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1：500；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司37 ℃ 孵育60min，PBS 洗3次，5min/次；DAB法顯色5～10min，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。光鏡下觀察HDAC8在各組小鼠肺組織中的表達(dá)分布。

4 Western Blot檢測肺組織中HDAC8水平

取右側(cè)新鮮肺組織30～50mg加入RIPA裂解液(含10%PMSF)，冰上剪碎勻漿，超聲粉碎，4℃12000g離心，30min后取上清。BCA法測蛋白濃度，調(diào)整濃度并變性后，采用SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳（80V，30min；120V，90min）分離。將蛋白轉(zhuǎn)染到PVDF膜上（0.25mA，60min），脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2h。HDAC8多克隆抗體（1∶1000，美國，Novus）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育1h，ECL法檢測蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)成像（美國UVP公司），Gel-Pro analyzer凝膠定量分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

5 HDAC8酶活性熒光定量分析

取右側(cè)新鮮肺組織，采用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒提取核蛋白，BCA法測定蛋白濃度，熒光法[12]檢測肺組織中HDAC8酶活性，操作方法按試劑盒（HDAC8 Activity Fluorometric Assay Kit，美國，BioVision）內(nèi)附說明書操作，其基本步驟如下： HA1溶用液蒸餾水稀釋10倍， 核蛋白用HA2溶液稀釋至1μg/μl，按照樣品孔、空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔加樣，37℃ 孵育 60～90min，每孔再加入 150μl HA3 溶液，37℃孵育30～45min，150μl HA1溶液洗板3次，用HA1溶液將HA4稀釋200倍后，取50μl加入至各反應(yīng)孔中，搖床上室溫孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，用HA1溶液將HA5稀釋1000倍后，取50μl加入至各反應(yīng)孔中，室溫孵育60min，150μl HA1溶液洗板4次，每孔加入100μl HA6溶液，避光室溫孵育10min，每孔加入50μl HA7溶液，立即測定OD450nm，計(jì)算HDAC8酶活性。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤水平

HE染色觀察顯示，正常小鼠肺組織中氣道上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜連續(xù)完整，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤幾不可見；與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞脫落，基底膜暴露，氣道及血管周圍可見大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤（圖1），表明哮喘建模成功。

圖1肺組織HE染色。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，炎癥細(xì)胞；比例尺，50μmFig. 1 HE stain of lung tissue. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’,enlarged image of the square frame in B; arrows indicate inflammatory cells; scale bar, 50μm

2 HDAC8在肺組織中的免疫組織化學(xué)表達(dá)

2.1 哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞高表達(dá)HDAC8

正常小鼠氣道上皮細(xì)胞質(zhì)中可見少量的HDAC8表達(dá)。與正常小鼠相比，哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞中HDAC8棕黃色染色明顯，免疫反應(yīng)性明顯增強(qiáng)（圖2）。

圖2 HDAC8在各組小鼠氣道上皮細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細(xì)胞；比例尺，50μmFig. 2 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the airway epithelial cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression;scale bar, 50μm

2.2 哮喘小鼠氣道血管周圍炎癥細(xì)胞高表達(dá)HDAC8

免疫組織化學(xué)染色顯示，正常小鼠肺組織氣道血管結(jié)構(gòu)清晰，周圍并未發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤；與正常小鼠相比，哮喘小鼠氣道血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，且浸潤的炎癥細(xì)胞中可見HDAC8顯著表達(dá)，但HDAC8在炎癥細(xì)胞中表達(dá)水平并不均勻（圖3）。

圖3 HDAC8在各組小鼠氣道血管周圍炎癥細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細(xì)胞；比例尺，50μmFig. 3 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the inflammatory cells around the vascular and airway. A, lung tissue of the normal mouse; A’,enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

2.3 哮喘小鼠血管平滑肌細(xì)胞高表達(dá)HDAC8

正常小鼠肺動(dòng)脈和微血管平滑肌中未見HDAC8表達(dá)；OVA霧化8周后，可見哮喘小鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞以及微血管平滑肌中HDAC8表達(dá)呈強(qiáng)陽性，尤其在肺微血管平滑肌中可見HDAC8表達(dá)水平明顯升高（圖4）。

2.4 哮喘小鼠肺泡腔炎癥細(xì)胞高表達(dá)HDAC8

正常小鼠肺泡腔中僅見少量炎癥細(xì)胞，且炎癥細(xì)胞中HDAC8表達(dá)極少。與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺泡腔中可見大量以巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞，且在這些炎癥細(xì)胞中HDAC8表達(dá)水平顯著增多（圖5）。

3 哮喘小鼠肺組織HDAC8水平升高

Western blot進(jìn)一步檢測HDAC8在肺組織中的總體水平，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，哮喘小鼠肺組織中HDAC8的總體水平顯著升高（圖6A、B）。

4 哮喘小鼠肺組織中HDAC8活性增強(qiáng)

熒光定量分析檢測HDAC8活性發(fā)現(xiàn)，在正常肺組織HDACs活性較低，哮喘小鼠肺組織中HDAC8活性較正常小鼠顯著升高（圖6C）。

討 論

目前哺乳類HDACs已知有4類18種，不同類別的HDACs通過調(diào)節(jié)不同底物的乙?；揎梾⑴c體內(nèi)多種應(yīng)激性反應(yīng)[13]。其中HDAC8是I類HDACs家族的重要成員，在全身多臟器中均有表達(dá)，與體內(nèi)T細(xì)胞增殖分化、炎性免疫應(yīng)答、以及平滑肌細(xì)胞分化收縮等過程均密切相關(guān)[14-16]。本次研究結(jié)果顯示，HDAC8在健康小鼠肺組織中表達(dá)極少，而在以嗜酸性炎癥為主的慢性哮喘小鼠肺組織中表達(dá)水平和酶活性均顯著上調(diào)。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)HDAC8高表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞、氣道血管周圍以及肺泡腔炎癥細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，尤其在新生血管的平滑肌細(xì)胞中可見HDAC8規(guī)律且特異性表達(dá)。然而有意思的是在支氣管氣道平滑肌細(xì)胞中HDAC8表達(dá)卻并不明顯。本團(tuán)隊(duì)既往的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘致病過程中血管平滑肌細(xì)胞的表型、結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生病理性改變，且直接參與哮喘時(shí)血管的損傷修復(fù)以及再生和重塑過程[17-19]。綜合HDAC8在哮喘肺組織血管中的表達(dá)特點(diǎn)以及哮喘致病時(shí)血管表型和功能的異常改變，我們推測HDAC8很可能參與哮喘致病時(shí)血管的再生與重塑。

圖4 HDAC8在小鼠血管平滑肌細(xì)胞中的免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，正常小鼠肺內(nèi)動(dòng)脈；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，正常小鼠肺內(nèi)微血管；B’，B中方框內(nèi)放大圖像；C，哮喘組小鼠肺內(nèi)動(dòng)脈；C’，C中方框內(nèi)放大；D，哮喘組小鼠肺內(nèi)微血管；D’，D中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細(xì)胞；比例尺，50μmFig. 4 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the vascular smooth muscle cells. A, pulmonary artery of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, pulmonary capillaries of the normal mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; C, pulmonary artery of the asthma mouse; C’, enlarged image of the square frame in C; D, pulmonary capillaries of the asthma mouse; D’, enlarged image of the square frame in D; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

盡管哮喘和COPD都屬于呼吸系統(tǒng)氣道炎癥性疾病，但研究發(fā)現(xiàn)在COPD患者體內(nèi)HDAC8表達(dá)水平顯著低于健康人，而我們的研究結(jié)果卻提示哮喘小鼠體內(nèi)HDAC8表達(dá)水平顯著升高。HDAC8這一截然相反的變化趨勢(shì)很可能是由于哮喘和COPD兩者在炎癥細(xì)胞表型和分子特征上皆不同所致[20]，即COPD則主要是由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，而我們的哮喘模型主要表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥，而哮喘中HDAC8的升高很可能與哮喘中嗜酸粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)。從免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也可看出，在哮喘肺組織氣道血管周圍以及肺泡腔炎癥細(xì)胞中HDAC8表達(dá)并不均勻，嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中HDAC8的表達(dá)水平明顯高于其他炎癥細(xì)胞。

目前針對(duì)HDAC8的選擇性抑制劑的研究越來越受到人們的重視，其中PCI-34051是一個(gè)低分子量的異羥肟酸類化合物，是HDAC8的特異性抑制劑，應(yīng)用PCI-34051干預(yù)哮喘小鼠能夠顯著緩解哮喘氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)[21]。盡管PCI-34051作用于哮喘的具體機(jī)制尚不明確，但有研究顯示HDAC8能夠調(diào)控組蛋白上H3K9、H2BK12、H3K18的乙?；?，影響下游基因轉(zhuǎn)錄激活[22]，這一結(jié)果很有可能為HDAC8作用于哮喘的具體機(jī)制研究帶來新突破。

圖5 HDAC8在各組小鼠肺泡腔炎癥細(xì)胞的免疫組織化學(xué)表達(dá)。A，正常小鼠肺組織；A’，A中方框內(nèi)放大圖像；B，哮喘組小鼠肺組織；B’，B中方框內(nèi)放大；箭頭，HDAC8陽性染色細(xì)胞；比例尺，50μmFig. 5 Immunohistochemical expression of HDAC8 in the alveolar inflammatory cells. A, lung tissue of the normal mouse; A’, enlarged image of the square frame in A; B, lung tissue of the asthma mouse; B’, enlarged image of the square frame in B; arrows indicate cells with HDAC8 positive expression; scale bar, 50μm

圖6 HDAC8在各組小鼠肺組織中的表達(dá)水平和活性檢測。 A，HDAC8水平的Western blot檢測代表性結(jié)果；B，HDAC8水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，HDAC8活性熒光檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與正常組比較，P＜0.01Fig. 6 Detection for expression level and activity of HDAC8 in the lung tissue. A, representative results of HDAC8 level detected by Western blot; B,statistical analysis for expression level of HDAC8 detected by Western blot; C, statistical analysis for activity of HDAC8 detected by fluorometric assay;*, P＜0.01, compared with the normal group