方 宇，王 飛，賈憲波，林陳強(qiáng)，張 慧，陳龍軍，陳濟(jì)琛

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，福建 福州 350003）

生物固氮是指在固氮微生物的作用下將空氣中的氮?dú)膺€原成氨的過程，是全球生態(tài)系統(tǒng)最主要的氮源[1]。固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)土壤氮素固定及維持氮素循環(huán)具有重要意義。固氮菌體內(nèi)存在一種具有催化功能的固氮酶，固氮酶是由nifD和nifK基因編碼的鉬鐵蛋白和nifH編碼的鐵蛋白構(gòu)成。nifH基因只存在于固氮菌中，其核酸序列保守，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和16S rRNA基因相一致，是研究固氮菌群落結(jié)構(gòu)的最好標(biāo)記基因[2]。

為了獲得作物高產(chǎn)，化肥施用量不斷增加，化肥的過量施用對(duì)土壤質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，導(dǎo)致土壤質(zhì)量明顯下降[3]。因此，改善施肥方式，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展迫在眉睫。綠肥是有機(jī)肥的一種，它是一種養(yǎng)分完全的優(yōu)質(zhì)生物能源，可提供作物所需養(yǎng)分、改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，是保持土壤質(zhì)量和農(nóng)業(yè)可持續(xù)利用的措施之一。紫云英（Astrɑgɑlus sinicus）是我國水稻產(chǎn)區(qū)主要的綠肥作物，水稻可以利用紫云英的生物固氮能力，減少對(duì)化學(xué)氮肥的依賴，降低生態(tài)環(huán)境壓力。在水稻種植區(qū)利用冬閑種植綠肥，可以有效改善土壤性狀，并在一定程度上替代部分化學(xué)肥料，減少氮肥用量[4]。據(jù)報(bào)道化肥配施綠肥有利于培肥土壤[5]和作物增產(chǎn)[6]。因此建立綠肥化肥配施的施肥體系對(duì)于保障糧食安全和節(jié)約自然資源具有十分重要的意義。

研究表明施肥制度對(duì)土壤固氮菌有一定影響。例如Berthrong等[7]報(bào)道添加氮肥明顯改變了森林土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)。Tan等[8]也報(bào)道水稻土壤添加氮肥后快速改變了固氮菌的群落結(jié)構(gòu)。然而Wakelin等[9]研究顯示施用尿素并沒有影響固氮菌群落。黎睿智[10]指出單施有機(jī)肥和無機(jī)有機(jī)肥混施能在一定程度上提升土壤固氮菌的豐富度和多樣性，而單施化肥的土壤固氮菌的多樣性和豐富度會(huì)有所下降。有機(jī)肥的施用量對(duì)土壤固氮菌也有顯著影響，低量有機(jī)肥能夠增加玉米土壤固氮菌多樣性[11]。然而目前關(guān)于綠肥對(duì)土壤固氮菌影響的研究較少。僅王秀呈[12]發(fā)現(xiàn)翻壓紫云英增加了土壤固氮菌的豐度。有關(guān)綠肥配施減量化肥對(duì)土壤固氮菌群落影響的研究尚屬空白。因此為了揭示綠肥配施減量化肥對(duì)我國南方水稻土壤固氮菌群落多樣性的影響，本研究以紫云英化肥定位試驗(yàn)站土壤為研究對(duì)象，通過熒光定量和高通量測(cè)序技術(shù)研究了綠肥配施不同比例化肥處理下土壤固氮菌豐度和群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及其與土壤理化性質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系，以期為該區(qū)合理施肥提供科學(xué)依據(jù)，從而促進(jìn)水稻土壤的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

紫云英定位試驗(yàn)站位于福州市白沙鎮(zhèn)，地理位置為北緯26°13′31″，東經(jīng)119°04′10″，海拔高度15.4 m，年均降雨量1 350.9 mm，年日照時(shí)數(shù)1 812.5 h，年平均溫度19.5℃，無霜期311 d；土壤類型為滲育型水稻土黃泥田。紫云英-水稻長期輪作定位試驗(yàn)始于2008年，試驗(yàn)開始時(shí)土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)24.4 g·kg-1、全氮 1.23 g·kg-1、堿解氮 171.6 mg·kg-1、速效磷13.5 mg·kg-1、速效鉀83.4 mg·kg-1、pH 4.78。

本研究共設(shè)置5個(gè)處理：（1）對(duì)照，不施紫云英和化肥，CK；（2）單施化肥，NPK；（3）紫云英配施 80%化肥，MF80；（4）紫云英配施 60%化肥，MF60；（5）紫云英配施40%化肥，MF40。NPK處理的年化肥用量為N 135 kg·hm-2、P2O554 kg·hm-2、K2O 94.5 kg·hm-2。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)小區(qū)，完全隨機(jī)排列，每個(gè)小區(qū)面積為15 m2。紫云英前兩年為異地方式翻壓，第三年起于水稻成熟前套播紫云英種子（播種密度為22.5 kg·hm-2），于次年4月份翻壓。紫云英翻壓量2014年前鮮草量為18 000 kg·hm-2，2014年起翻壓量為22 500 kg·hm-2。

1.2 樣品采集

土樣采集時(shí)間為2016年8月（水稻分蘗期）。各試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)按“S”形取樣，隨機(jī)布點(diǎn)采集耕作層（0～20 cm）土壤樣品，混勻后置于無菌自封袋迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。部分土樣風(fēng)干后測(cè)定土壤養(yǎng)分；部分土樣置于-80℃保存用于分子試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤基本養(yǎng)分測(cè)定參照魯如坤《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[13]。土壤pH值用蒸餾水浸提（土水比1∶2.5）pH計(jì)測(cè)定；有機(jī)質(zhì)用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法；全氮用凱氏定氮法；堿解氮用堿解擴(kuò)散法；NH+4-N用2 mol·L-1KCl溶液浸提-靛酚藍(lán)比色法；NO-3-N用雙波長分光光度法[14]。

1.3.2 土壤微生物DNA的提取

采用 PowerSoil DNA Isolation Kit（Mobio，USA）試劑盒提取土壤微生物總DNA。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品質(zhì)量，并用Nanodrop核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop 2000）測(cè)定DNA的純度和濃度。

1.3.3 土壤固氮菌nifH基因的熒光定量分析

選用引物nifH-F（AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC）和 nifH-R（TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT）擴(kuò)增固氮菌nifH基因[15]。PCR體系為：2×Tɑq PCR Master Mix（Takara，大連，中國）25 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol·L-1），DNA模板2 μL，用滅菌超純水補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物回收，連接至pMD19-T載體（Takara，大連，中國），轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆測(cè)序分析。提取nifH基因陽性質(zhì)粒，用Nanodrop核酸蛋白測(cè)定儀（Nanodrop 2000）測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算nifH基因拷貝數(shù)，按10倍梯度進(jìn)行稀釋，用于制備標(biāo)準(zhǔn)品。熒光定量PCR在ABI 7500型熒光定量PCR儀（ABI，CA，USA）上進(jìn)行，反應(yīng)體系（20 μL）為：SYBRGreen qPCR Master Mix 16.4 μL，上下游引物各0.8 μL（10 μmol·L-1），DNA模板2 μL。每個(gè)樣品3次重復(fù)。熒光定量PCR采用兩步法進(jìn)行，PCR條件為95℃預(yù)變性10 min；95℃15 s，58℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.3.4 固氮菌nifH基因的高通量測(cè)序分析

固氮菌nifH基因采用nifH-F/nifH-R引物擴(kuò)增，PCR體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，上下游引物各 0.8 μL（5 μmol·L-1），F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA約10 ng，超純水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增時(shí)在每個(gè)樣品的上游引物5′端添加一段長度為6個(gè)堿基的特異性堿基序列（barcode），用于區(qū)分樣品。將擴(kuò)增的nifH基因PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）純化后，使用 QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）測(cè)定濃度，將每個(gè)樣品3次重復(fù)的PCR產(chǎn)物等摩爾混勻，用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序。測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

采用Flash和Trimmomatic軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。首先根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列。數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)如下：（1）過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；（2）根據(jù)PE reads之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)reads拼接成一條序列，最小重疊長度為10 bp；（3）拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；（4）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

按樣本最小序列進(jìn)行抽平，之后用Uclust v1.2.22軟件對(duì)序列進(jìn)行聚類合并，選擇97%作為相似性閾值。主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA）采用R軟件（3.2.1版本）完成。數(shù)據(jù)方差分析和相關(guān)性分析采用SPSS 19.0軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 綠肥配施減量化肥對(duì)水稻產(chǎn)量和土壤理化性質(zhì)的影響

綠肥配施減量化肥對(duì)水稻產(chǎn)量（2009—2016年8年平均產(chǎn)量）的影響見圖1。MF80處理的產(chǎn)量最高，為 8528 kg·hm-2；CK處理產(chǎn)量最低，僅為 7002 kg·hm-2。與NPK處理相比，翻壓紫云英配施減量化肥的3個(gè)處理水稻產(chǎn)量與其無顯著差異（P＞0.05）。綜合化肥用量和水稻產(chǎn)量，MF60（產(chǎn)量為8194 kg·hm-2）被認(rèn)為是一種既環(huán)保又高產(chǎn)的施肥措施。

綠肥配施減量化肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響見表1。各施肥處理對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)含量無顯著影響（P＞0.05）。與NPK處理相比，綠肥配施減量化肥處理組明顯增加了土壤全氮含量（P＜0.05），而綠肥處理間無顯著差異（P＞0.05）。與CK相比，施肥處理（除MF40處理）明顯增加了土壤堿解氮（AN）含量，其中MF60處理的AN含量最高；綠肥配施減量化肥處理組（除MF60處理）的土壤AN含量與NPK處理相當(dāng)。不同施肥處理對(duì)土壤銨態(tài)氮含量的影響無顯著差異。與NPK處理相比，綠肥處理組（除MF40處理）土壤硝態(tài)氮含量無明顯變化。翻壓紫云英處理組土壤pH高于NPK處理。

圖1 不同施肥處理的水稻產(chǎn)量Figure 1 Rice yield under different fertilizer regimes

2.2 綠肥配施減量化肥對(duì)土壤固氮菌豐度的影響

由圖2可知，不同施肥處理對(duì)土壤固氮菌豐度產(chǎn)生了顯著影響。與NPK處理相比，綠肥配施減量化肥（除MF40處理）明顯增加了土壤固氮菌豐度。MF60處理nifH基因的拷貝數(shù)最高，為每克干土2.45×109基因拷貝數(shù)；CK和MF40處理固氮菌豐度最低，為0.73×109基因拷貝數(shù)。對(duì)土壤固氮菌豐度和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2）得知，固氮菌豐度和土壤堿解氮、硝態(tài)氮和pH呈顯著正相關(guān)。

圖2 不同施肥處理土壤固氮菌豐度Figure 2 Abundance of soil nitrogen-fixing bacteria under different fertilizer regimes

表1 不同施肥處理下土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil properties under different fertilizer regimes

表2 固氮菌豐度和土壤理化因子的相關(guān)性分析Table 2 Spearman′s correlation coefficients between the abundance of nitrogen-fixing bacteria and soil properties

固氮菌是環(huán)境變化的重要生物學(xué)指示，施肥對(duì)固氮菌有顯著的影響，但是影響效果還沒有達(dá)成一致的共識(shí)。長期施肥會(huì)對(duì)土壤固氮菌的群落大小產(chǎn)生顯著的影響[7，16]。本研究中不同處理固氮菌豐度對(duì)施肥的響應(yīng)明顯不同。與單施化肥處理相比，紫云英配施減量化肥處理（除MF40處理）土壤中固氮菌豐度均有大幅度提高?？梢?，綠肥的施用和化肥的用量對(duì)固氮菌豐度都會(huì)產(chǎn)生顯著影響。氮肥（例如N和NPK）的輸入減少了固氮菌豐度可能是由于土壤酸化或高氮含量造成的[17]。Tan等[8]也報(bào)道單施氮肥降低了水稻根際固氮菌的豐度，而且高量氮肥也降低了高粱根際固氮菌的豐度[18]。本研究中翻壓紫云英配施減量化肥處理增加了土壤pH值，而相關(guān)性分析表明固氮菌豐度與土壤pH值呈顯著正相關(guān)，以及NPK處理含有高量氮肥，可能導(dǎo)致NPK處理的土壤固氮菌豐度較低。因此平衡施肥對(duì)控制土壤固氮菌的豐度至關(guān)重要。通過相關(guān)性分析得知，土壤固氮菌豐度與堿解氮、硝態(tài)氮和pH呈顯著正相關(guān)。而Reed等[19]報(bào)道固氮菌豐度與氮濃度呈負(fù)相關(guān)。侯海軍等[20]發(fā)現(xiàn)固氮菌的豐度與堿解氮含量呈負(fù)相關(guān)，氮肥會(huì)抑制固氮菌的生長。Wang等[17]認(rèn)為這些不一致性可能是由于施肥制度對(duì)土壤產(chǎn)生的多重影響造成的，例如土壤碳[21]、氮的可利用性[22]、pH[23]、土壤類型[24]、地上作物[8]等都會(huì)導(dǎo)致肥料對(duì)固氮菌的影響不一致。值得注意的是施肥制度對(duì)固氮菌豐度的影響存在季節(jié)波動(dòng)。與取樣時(shí)間相比，施肥措施僅僅是一個(gè)次要影響因子[25-26]。例如Reardon等[27]揭示不同的試驗(yàn)?zāi)攴菹噍^于施肥對(duì)固氮菌豐度的影響更大。多重因子，例如試驗(yàn)地氣溫、水稻生長狀況、土壤類型以及取樣時(shí)間等都可能引起本研究中固氮菌豐度與環(huán)境因子的關(guān)系和其他研究的差異。

2.3 綠肥配施減量化肥對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 測(cè)序結(jié)果和多樣性指數(shù)

使用Illumina Miseq技術(shù)對(duì)固氮菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，共得到有效序列218 607條，每個(gè)樣品含有10 891～18 937條序列，平均長度為380 bp。按照97%相似度對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU分析，共得到724個(gè)OTUs。樣品測(cè)序覆蓋度在97.19%～97.52%，稀釋性曲線趨于飽和，表明測(cè)序深度可以反映土壤樣品固氮菌的信息。

綠肥配施減量化肥對(duì)土壤固氮菌多樣性的影響見表3。各施肥處理對(duì)土壤固氮菌的OTU數(shù)目和Chao1指數(shù)沒有顯著影響（P＞0.05）。與NPK處理相比，綠肥配施減量化肥明顯降低了土壤固氮菌的Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)；而綠肥處理之間無顯著差異。與NPK處理相比，紫云英配施減量化肥的處理下土壤固氮菌的多樣性指數(shù)降低可能是紫云英秸稈還田后促進(jìn)了某些優(yōu)勢(shì)物種，從而降低了物種的多樣性。

2.3.2 土壤固氮菌的群落組成

在門分類水平（圖3），變形菌門（Proteobacteria）是固氮菌的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，占總OTU的59.72%～80.86%，others包括廣古菌門和藍(lán)菌門，其余OTU則隸屬于未分類的細(xì)菌門。與NPK處理相比，翻壓紫云英的施肥處理降低了變形菌門的豐度，而未分類的細(xì)菌種類增加。可見，翻壓紫云英改變了土壤固氮菌優(yōu)勢(shì)類群的相對(duì)豐度，從而影響了固氮菌的群落組成。在綱水平（圖4），土壤固氮菌主要隸屬于α-變形菌、β-變形菌和δ-變形菌，還包括少量未分類的變形菌門種類和未分類的細(xì)菌種類，others則包括甲烷微菌綱、未分類的藍(lán)菌門種類。固氮菌的種類并不局限于某一屬或某一種，而是廣泛的分布在細(xì)菌界中，如古細(xì)菌中的廣古菌門和真細(xì)菌中的變形菌門、放線菌門、藍(lán)菌門、厚壁菌門及綠菌門等[28]。在本研究中固氮菌主要集中在變形菌門，這與徐鵬霞[29]和Collavino等[30]的研究結(jié)果相一致。其他序列少量分布于藍(lán)菌門，還有17%～32%屬于未分類的細(xì)菌。在變形菌門中，本研究土壤中檢測(cè)到α-變形菌、β-變形菌和δ-變形菌的存在，而γ-變形菌未檢測(cè)到。Izquierdo等[31]也報(bào)道了一些熱帶土壤中缺乏γ-變形菌的固氮菌。在屬水平（圖5），大部分優(yōu)勢(shì)類群為未分類的種類，包括 unclassified Alphaproteobacteria、unclassified Proteobacteria、unclassified Deltaproteobacteria、unclassified Beltaproteobacteria。而地桿菌屬（Geobɑcter）是唯一一個(gè)可分類的優(yōu)勢(shì)種群，豐度為6.88%～13.70%。地桿菌屬在CK中豐度最高為13.70%，MF40處理中豐度最低為6.88%。與NPK處理相比，翻壓綠肥顯著降低了地桿菌屬的豐度，但綠肥處理間無顯著差異。此外土壤中還含有豐度較低（相對(duì)豐度＜1%）的一些固氮菌屬，如鐵氧化細(xì)菌（Sideroxydɑns）、慢生根瘤菌屬（Brɑdyrhizobium）、厭氧黏細(xì)菌（Anɑeromyxobɑcter）、念珠藻屬（Nostoc）、紅螺菌屬（Rhodospirillum）、固氮弓菌屬（Azoɑrcus）、紅微菌屬（Rhodomicrobium）、互營桿菌屬（Syntrophobɑcter）、微鞘藻屬（Microcoleus）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonɑs）等。值得注意的是，本研究中與紫云英關(guān)系密切的根瘤菌豐度較低，僅為0.55%～0.73%。原因可能是紫云英于每年4月翻壓入土，到8月取樣時(shí)紫云英大部分物質(zhì)已經(jīng)腐解[32]。

表3 不同施肥處理固氮菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indices of nitrogen-fixing bacteria under different fertilizer regimes

圖3 不同施肥處理土壤固氮菌門水平組成Figure 3 Composition of nitrogen-fixing bacteria at the phylum level under different fertilizer regimes

2.3.3 土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析

圖4 不同施肥處理土壤固氮菌綱水平組成Figure 4 Composition of nitrogen-fixing bacteria at the class level under different fertilizer regimes

圖5 不同施肥處理土壤固氮菌屬水平組成Figure 5 Composition of nitrogen-fixing bacteria at the genus level under different fertilizer regimes

圖6 不同施肥處理土壤固氮菌主坐標(biāo)分析Figure 6 Principal coordinates analysis（PCoA）of soil nitrogen-fixing bacteria under different fertilizer regimes based on the bray-curtis distance

我們基于OTU水平對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（圖6）。結(jié)果顯示：第一和第二排序軸對(duì)固氮菌群落變異的解釋量分別為36.76%和25.08%，總解釋量達(dá)到61.84%。由圖6可知，施肥處理對(duì)土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響，CK和NPK處理固氮菌的群落結(jié)構(gòu)較相似，而翻壓紫云英的所有施肥處理都與NPK處理距離較遠(yuǎn)，表明翻壓紫云英明顯改變了土壤固氮菌的群落結(jié)構(gòu)。而在翻壓紫云英的處理間，MF40和MF80處理的樣本距離較近，表明兩者的固氮菌群落結(jié)構(gòu)較相似，而MF60與它們距離較遠(yuǎn)。主坐標(biāo)分析表明紫云英配施減量化肥處理與NPK處理的土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。有研究表明，氮肥和有機(jī)肥的施用會(huì)影響土壤固氮菌的群落組成[33]。本研究中與CK和NPK處理相比，翻壓紫云英的減量化肥處理土壤固氮菌組成發(fā)生了明顯改變，可見綠肥和化肥用量都影響了固氮菌的群落組成。與單施化肥相比，翻壓紫云英處理改變了土壤理化性質(zhì)，而水稻的根系分泌物可能也會(huì)隨之產(chǎn)生變化，分泌物的變化改變了土壤的微環(huán)境，從而引起土壤固氮菌群落組成的變化。

2.3.4 土壤固氮菌與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

圖7 土壤固氮菌群落組成與土壤因子的相關(guān)性分析Figure 7 Spearman′s correlation heatmap of nitrogen-fixing bacterial community composition at the genus level and soil properties

對(duì)固氮菌群落組成（屬水平）和環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析見圖7。由圖7可知，環(huán)境因子和土壤固氮菌群落有著顯著的相關(guān)性，尤其是土壤TN和AN。土壤 TN、AN 含量和 Anɑbɑenɑ、unclassified Nostocaceae呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與unclassified Proteobacteria、unclassified Betaproteobacteria和 unclassified Desulfuromonadales呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。土壤pH與固氮菌豐度也有顯著的相關(guān)性，例如pH與unclassified Proteobacteria和unclassified Betaproteobacteria呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與Anɑbɑenɑ、unclassified Nostocaceae呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。Juraeva等[34]研究發(fā)現(xiàn)，土壤TN含量能夠影響固氮菌的分布。何冬華等[35]和董志新等[36]研究報(bào)道pH對(duì)固氮菌群落也會(huì)產(chǎn)生顯著影響。本研究中環(huán)境因子與固氮菌群落組成的相關(guān)性分析說明土壤中固氮菌的群落結(jié)構(gòu)可由多個(gè)土壤性質(zhì)共同影響和控制。

3 結(jié)論

（1）在長期施肥條件下，翻壓紫云英配施減量化肥有利于提升土壤肥力和固氮菌的數(shù)量，并且提升幅度與化肥用量有關(guān)。

（2）翻壓紫云英配施減量化肥處理對(duì)土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。翻壓紫云英和化肥用量都是影響土壤固氮菌組成的重要因素。