王 蕊，朱 珂，李 剛，王 晶，李 冰，修偉明，劉惠芬，趙建寧，楊殿林

（1.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

不同土地利用方式可以引起陸地生態(tài)以及生物地球化學(xué)循環(huán)過程的變化，導(dǎo)致土壤性質(zhì)變化和土地生產(chǎn)力改變[1]。作為人類和社會生存與發(fā)展必不可少的自然資源——森林生態(tài)系統(tǒng)迫于人類對糧食需求的增加而受到嚴(yán)重威脅，目前全球已有大面積的森林改為耕地用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2-3]。與林地相比，耕地的土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化，生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生改變，土壤質(zhì)量也有顯著差異[4-5]。在我國東北地區(qū)有大面積森林分布，自20世紀(jì)50年代以來，部分林地改為耕地[6]，雖然糧食產(chǎn)量得到了提升，但亟待開展土壤生態(tài)系統(tǒng)對這種變化的響應(yīng)相關(guān)研究。同時(shí)，在開墾林地的過程中一小部分空地逐漸發(fā)展成為天然草地，這種土地利用轉(zhuǎn)變方式是否為東北地區(qū)生態(tài)重建提供新的參考及其土壤生態(tài)系統(tǒng)變化情況，同樣需要相關(guān)研究以提供理論依據(jù)。

土壤微生物多樣性是土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化、循環(huán)和利用的基礎(chǔ)，是土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性和可持續(xù)性的保障[7]。真菌作為土壤微生物群落中的關(guān)鍵功能類群，能夠動(dòng)態(tài)地適應(yīng)改變的環(huán)境，參與分解有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)土壤團(tuán)聚體形成、穩(wěn)固和改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物對氮磷等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收[8-9]，推動(dòng)土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量流動(dòng)和生物轉(zhuǎn)化循環(huán)過程[10]，其多樣性變化可以指示土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。Biolog微平板技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析，具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、無需分離純種微生物、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，能反映微生物種群的總體活性[11]。隨著Biolog微平板技術(shù)的不斷發(fā)展，最初僅被用于絲狀真菌鑒定的Biolog FF微平板培養(yǎng)方法，逐漸用于土壤真菌的碳源利用功能多樣性分析[12]。研究表明，土壤真菌群落多樣性受土壤質(zhì)地、土壤養(yǎng)分、pH值和植被等影響[13-17]，能夠反映土壤生態(tài)過程的變化。目前，土地利用方式對土壤生態(tài)系統(tǒng)影響的研究主要集中在對土壤有機(jī)碳[18]、土壤養(yǎng)分[19-20]、細(xì)菌功能多樣性[21]、細(xì)菌和真菌遺傳和結(jié)構(gòu)多樣性的影響[22-23]等方面，對土壤真菌群落代謝特征等的影響尚缺乏研究。

本研究采用Biolog FF微平板培養(yǎng)方法測定東北丘陵區(qū)不同土地利用方式（林地、耕地和草地）土壤真菌群落代謝特征的變化，并耦合理化性質(zhì)測定分析土壤真菌代謝特征變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，旨在明確不同土地利用方式下土壤真菌群落代謝特征，探索土地利用類型與土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，從而為東北地區(qū)土壤的可持續(xù)合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于吉林省四平市伊通滿族自治縣，地處長白山脈向松遼平原過渡的丘陵地帶。自20世紀(jì)50年代以來，該地區(qū)進(jìn)行了大規(guī)模的開墾和采伐，形成了林地、耕地和草地等多樣的土地利用類型。本研究選擇在伊通滿族自治縣管轄的西葦鎮(zhèn)的西葦林場和北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司吉林省試驗(yàn)示范基地進(jìn)行，試驗(yàn)示范基地的耕地由林地轉(zhuǎn)型而來。試驗(yàn)地的地理位置為125°20′N，43°15′E，屬于中溫帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫4.6°C，無霜期約為138 d，年平均降雨量627.8 mm，土壤為白漿土，是吉林省的典型土壤類型，也是東北地區(qū)重要的土壤資源[24]。

1.2 研究對象

以林地（F）、耕地（A）和草地（M）3種土地利用類型為研究對象。林地為紅松林（Pinus korɑiensis），為林場的典型林分，林齡已達(dá)50年以上。耕地為農(nóng)用坡耕地，緊鄰林地，23年前出于擴(kuò)大耕地面積的需要，林場將部分林地樹木砍伐后用作農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，其耕作制度為玉米連作，常年使用化肥，不施有機(jī)肥，近3年化肥（N∶P∶K=15∶15∶15復(fù)合肥）施用量平均為750 kg·hm-2，以基肥形式一次性施入，由于地處丘陵地帶，當(dāng)?shù)赜衩咨a(chǎn)均無法采用機(jī)械化，只能靠人工種植和收獲，田間管理措施按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)操作進(jìn)行。草地則是在林地樹木砍伐后，由一小部分未用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及其他用途的空地逐漸形成的天然草地，主要分布野艾蒿（Artemisiɑ lɑvɑndulifoliɑ）、一年蓬（Erigeron ɑnnuus）、突節(jié)老鸛草（Gerɑnium krɑmeri）等草本植物，同樣已有23年之久。

1.3 土壤樣品采集

在林地和草地樣地內(nèi)，分別設(shè)置3個(gè)15 m×15 m的標(biāo)準(zhǔn)樣方，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣方內(nèi)依據(jù)W形多點(diǎn)采樣法共設(shè)置15個(gè)采樣點(diǎn)；從試驗(yàn)基地中選取3個(gè)小區(qū)（面積為10 m×15 m）作為耕地樣地，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)同樣依據(jù)W形多點(diǎn)采樣法選取15個(gè)采樣點(diǎn)。采樣時(shí)去除表層的枯枝落葉，用直徑為3.5 cm的土壤采樣器采集0～15 cm的表層土壤。將同一處理同一小區(qū)（樣方）的土壤充分混勻形成一個(gè)混合樣品，裝入1個(gè)自封袋中，放入低溫樣品儲藏箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣土分為3份，其中1份存放在4℃冰箱用于測定土壤真菌功能多樣性，1份風(fēng)干后用于測定土壤理化性質(zhì)。各處理的土壤基本理化性質(zhì)見表1。

1.4 土壤真菌群落代謝特征分析

土壤真菌群落代謝特征采用Biolog FF板測定（FF MicroPlate，Biolog，Hayward，CA，USA）[7]。稱取 5 g鮮土于盛有45 mL滅菌的NaCl溶液（0.85%）三角瓶中，恒溫培養(yǎng)振蕩器中180 r·min-1振蕩30 min；將振蕩后的土壤溶液稀釋1000倍，吸取150 μL稀釋液至Biolog FF板的微孔中，每個(gè)樣品各3板（3次重復(fù)），25℃恒溫培養(yǎng)168 h，每隔24 h讀取490 nm波長下的光密度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

選取培養(yǎng)96 h的光密度值計(jì)算平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）、Shannon 指數(shù)（H′）、Simpson指數(shù)（D）、McIntosh指數(shù)（U）和豐富度指數(shù)（S，被利用的碳源總數(shù)目，本研究中為Ci-R值大于0.20的孔數(shù)），計(jì)算公式如下：

式中：Ci為第i孔的吸光值；R為對照孔的吸光值；n為培養(yǎng)基碳源的種類數(shù)，Biolog-FF板的n值為95；Pi為第i孔的相對吸光值與整個(gè)平板相對吸光值總和的比值；ni是第i孔的相對吸光值（Ci-R）。

選取96 h的平均顏色變化率（AWCD）對真菌碳源利用進(jìn)行主成分分析。

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA）和主成分分析（Principle component analysis，PCA）。采用CANOCO 4.5.1軟件進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），并采用蒙特卡洛檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 土地利用方式對真菌平均顏色變化率的影響

平均顏色變化率（AWCD）表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了土壤微生物碳源利用的強(qiáng)度，可以表征土壤微生物活性[25]。由圖1可見，AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長而逐漸升高，各處理的AWCD值在培養(yǎng)24 h前均很小，表明土壤真菌對碳源的利用率很低；培養(yǎng)24 h后，林地和草地的AWCD值快速升高，而耕地的AWCD值在培養(yǎng)48 h后才表現(xiàn)出明顯升高趨勢。培養(yǎng)96 h時(shí)草地的AWCD值最高，林地次之，耕地最低；草地顯著高于林地和耕地（P＜0.05），而林地和耕地間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 土地利用方式對真菌多樣性指數(shù)的影響

微生物群落功能多樣性變化多采用Shannon指數(shù)（H′）、Simpson指數(shù)（D）、McIntosh指數(shù)（U）和豐富度指數(shù)（S）等指標(biāo)來表示，結(jié)果見表2。其中Shannon指數(shù)（H′）反映微生物群落物種的豐富度，Simpson指數(shù)（D）反映微生物群落常見物種的優(yōu)勢度，McIntosh指數(shù)（U）反映微生物群落物種的均勻度，豐富度指數(shù)（S）反映微生物利用碳源的數(shù)量[26-27]。4種多樣性指數(shù)的變化表現(xiàn)一致，即草地＞林地＞耕地。草地的Shannon指數(shù)（H′）和Simpson指數(shù)（D）均顯著高于林地和耕地（P＜0.05），林地顯著高于耕地（P＜0.05）；草地的McIntosh指數(shù)（U）同樣顯著高于林地和耕地（P＜0.05），但林地與耕地間差異不顯著（P＞0.05）；豐富度指數(shù)（S）的分析結(jié)果與McIntosh指數(shù)相同。不同處理的微生物群落Shannon指數(shù)（H′）、Simpson指數(shù)（D）、McIntosh指數(shù)（U）和豐富度指數(shù)（S）的變化整體上表現(xiàn)出與AWCD相似的規(guī)律，耕地的土壤真菌群落代謝活性和多樣性指數(shù)低于林地，而草地的土壤真菌群落代謝活性和多樣性指數(shù)顯著高于林地和耕地（P＜0.05）。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical-chemical properties of tested soils

圖1 不同土地利用方式土壤真菌的平均顏色變化率（AWCD）Figure 1 Average well color development（AWCD）of soil fungi under different land use types

2.3 土地利用方式對真菌碳源利用強(qiáng)度的影響

Biolog-FF微平板共有95種碳源，分為6大類，包括糖類（32種）、氨基酸類（13種）、羧酸類（17種）、聚合物類（6種）、胺類（6種）和其他類（9種），以此來反映真菌群落利用各類碳源的特征[7，28]。土地利用方式的轉(zhuǎn)變改變了真菌對Biolog FF板中碳源的總利用強(qiáng)度。與林地相比，耕地真菌對碳源的總利用強(qiáng)度降低了16.9%，差異不顯著（P＞0.05），而草地真菌對碳源的總利用強(qiáng)度升高了48.6%（P＜0.05）（圖2a）。土地利用方式轉(zhuǎn)變對Biolog FF板中每一類碳源的利用均有明顯影響（圖2b）。草地對糖類、羧酸類、其他類和氨基酸類碳源的利用能力顯著高于林地和耕地，而對胺類的利用能力顯著高于耕地（P＜0.05），與林地差異不顯著（P＞0.05）。除聚合物類外，林地對其他5種碳源的利用能力均高于耕地，但差異均不顯著（P＞0.05），而耕地對聚合物類的利用能力顯著高于林地（P＜0.05）。

2.4 土地利用方式對真菌碳源相對利用率的影響

由圖3可見，3種土地利用方式土壤真菌對各類碳源相對利用率最高的是羧酸類，占總碳源利用率的29.87%～35.77%，其次為糖類，占總碳源利用率的22.27%～23.79%，氨基酸類碳源的利用強(qiáng)度略低于糖類，占總碳源利用率的18.24%～19.30%。而對其他類、胺類和聚合物類碳源的相對利用率較低，分別占總碳源利用率的 9.87%～10.95%、4.51%～9.74% 和4.68～9.34%。耕地對羧酸類和聚合物類碳源的相對利用率高于林地，其中對聚合物類的相對利用率顯著高于林地（P＜0.05），而對糖類、其他類、胺類和氨基酸類碳源的相對利用率均低于林地，但差異均不顯著。草地對糖類、其他類、胺類和氨基酸類碳源的相對利用率均最高，對羧酸類和聚合物類碳源的相對利用率最低。這說明林地、耕地和草地土壤真菌對碳源的利用的偏好不同。

2.5 土壤真菌群落代謝特征的主成分分析

采用基于對不同底物碳源利用能力的主成分分析方法研究不同土地利用方式土壤真菌群落在碳源利用上的具體差異。95個(gè)主成分因子中前8個(gè)累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，根據(jù)提取的主成分個(gè)數(shù)一般要求累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到80%的原則[7]，共提取了5個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到83%，由于第3～5主成分貢獻(xiàn)率均較小，選取累積方差貢獻(xiàn)率為53.8%的前2個(gè)主成分PC1和PC2來分析土壤真菌群落的代謝特征。由圖4可見，耕地位于第二象限，林地位于第一和第三象限，草地位于第一和第四象限，耕地、林地和草地間沒有交集，說明林地、耕地和草地土壤真菌群落對底物碳源的代謝特征不同。

表2 不同土地利用方式土壤真菌多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of soil fungi under different land use types

圖2 不同土地利用方式土壤真菌碳源利用強(qiáng)度Figure 2 Utilization intensities of carbon sources by soil fungi under different land use types

圖3 不同土地利用方式土壤真菌碳源相對利用率Figure 3 Relative utilization rate of carbon substrate by soil fungi under different land use types

2.6 環(huán)境因子對真菌群落代謝特征的影響

圖4 不同土地利用方式土壤真菌群落代謝特征的主成分分析Figure 4 Principal component analysis of metabolic characteristics of soil fungi under different land use types

對3種土地利用方式土壤真菌群落對不同碳源利用的相對吸光值進(jìn)行RDA分析，確定環(huán)境因子對真菌群落代謝特征的影響。結(jié)果（圖5）表明，前2軸可以解釋真菌群落功能多樣性變化的65.4%，土壤總氮、有機(jī)質(zhì)、pH和含水量與環(huán)境第一軸呈極顯著正相關(guān)（R2分別為 0.922 7、0.899 1、0.818 9、0.907 8，P＜0.01），速效磷和硝態(tài)氮與環(huán)境第一軸呈極顯著負(fù)相關(guān)（R2分別為-0.747 5、-0.735 2，P＜0.01）。總氮、含水量、有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷和硝態(tài)氮與物種第一軸R2分別為0.919 7、0.904 8、0.896 2、0.816 8、-0.745 1、-0.732 8（P＜0.01），說明影響土壤真菌群落代謝特征的主要因素依次是總氮、含水量、有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷和硝態(tài)氮，表明真菌群落代謝特征變化是這6個(gè)環(huán)境因子協(xié)同作用的結(jié)果。

3 討論

圖5 不同土地利用方式土壤真菌群落代謝特征的RDA分析Figure 5 RDA analysis of metabolic characteristics of soil fungi under different land use types

AWCD值可以直觀反映土壤微生物群落代謝活性，群落功能多樣性指數(shù)能夠反映土壤微生物群落狀態(tài)與功能[29]。本研究中，耕地土壤真菌活性（AWCD）低于林地，而草地AWCD高于林地和耕地，說明草地土壤真菌對碳源消耗量最大，真菌活性最高，林地次之，而耕地土壤真菌對碳源消耗最少，真菌活性最小。同時(shí)多樣性指數(shù)表現(xiàn)出與AWCD相同的變化規(guī)律。此結(jié)果的產(chǎn)生可能是土地利用方式的轉(zhuǎn)變引起土壤理化性質(zhì)的改變所致。微生物種群數(shù)量和多樣性與土壤養(yǎng)分的含量密切相關(guān)[25，30]，且植被往往通過影響土壤基本理化性質(zhì)影響土壤生物區(qū)系[31]。本研究中耕地和草地與林地相比植被發(fā)生了顯著變化，由木本植物轉(zhuǎn)變?yōu)椴荼局参镆约昂瘫咀魑铮又亻L期的化肥施用，直接造成土壤理化性質(zhì)的改變。耕地與林地相比，土壤pH顯著降低，土壤酸化程度加強(qiáng)。這與Cai等[32]和Zhou等[33]的研究結(jié)果一致，直接導(dǎo)致了耕地土壤真菌活性及其多樣性的降低。與Fang等[34]研究結(jié)果相同，本研究中耕地的有機(jī)質(zhì)含量低于林地，農(nóng)田向土壤輸入碳的量低于自然生態(tài)系統(tǒng)[35]，隨著其自身碳源的不斷消耗，有機(jī)質(zhì)含量逐漸降低。真菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[36]，參與土壤有機(jī)質(zhì)循環(huán)過程[37]，而土壤有機(jī)底物的減少直接導(dǎo)致真菌數(shù)量及活性的降低，我們采用qPCR方法研究發(fā)現(xiàn)耕地真菌數(shù)量顯著低于林地（數(shù)據(jù)未列出），也證實(shí)了這一結(jié)論。但是本試驗(yàn)地為丘陵地，其獨(dú)特的地理特征也決定了其耕作制度，由于無法采用機(jī)械化，玉米的種植和收獲均采用人工方式，導(dǎo)致收獲后，除玉米地上部分移出農(nóng)田外，其根茬仍全部保留在農(nóng)田里。這可能是耕地土壤中有機(jī)質(zhì)含量較林地下降不顯著的原因。同時(shí)根茬也為以真菌為代表的分解微生物提供了一定數(shù)量的可以利用的有機(jī)碳源，但是不同土地利用類型下返還到土壤中碳源類型的改變，很可能造成真菌數(shù)量的顯著變化。與林地相比，草地的總氮、總磷、銨態(tài)氮和含水量顯著增加（P＜0.05），pH、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮也有明顯增加，草地中不同植物交錯(cuò)疊加，根系分泌物十分豐富，明顯提高了土壤的養(yǎng)分含量，為真菌的生存和繁殖提供了所需的營養(yǎng)和能源物質(zhì)。已有研究表明根系分泌物對土壤微生物的分布有重要作用，直接影響土壤微生物的數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)[38]。這些方面差異的綜合作用造成了草地真菌的活性和多樣性明顯變化。

本研究中，通過分析發(fā)現(xiàn)3種土地利用方式的真菌不僅對Biolog FF板中碳源的總利用強(qiáng)度不同，而且對Biolog FF板中每一類碳源的利用也有明顯不同。微生物對不同類型碳源的相對利用程度可以反映微生物的代謝功能類群[39]。土壤真菌對不同碳源相對利用率的差異分析表明，不同土地利用方式土壤真菌的主要功能代謝類群明顯不同，因此不同土地利用方式土壤真菌群落的代謝特征存在明顯差異。林地對6種碳源的相對利用率均位于草地和耕地之間，說明草地和耕地真菌對碳源的利用相比于林地向相反方向發(fā)展，土壤真菌對碳源利用的偏好發(fā)生了改變。這與本課題組研究發(fā)現(xiàn)土地利用方式轉(zhuǎn)變改變了土壤細(xì)菌對碳源利用的偏好（數(shù)據(jù)未列出）的結(jié)果一致。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)，本研究中東北丘陵區(qū)白漿土3種土地利用方式土壤真菌對各類碳源相對利用率最高的均是羧酸類，與胡國彬等[7]研究發(fā)現(xiàn)小麥和蠶豆間作系統(tǒng)下紅壤根際真菌對FF板中各類碳源相對利用率最高的是糖類的研究結(jié)果有所不同，說明土壤類型可能是決定真菌對碳源利用的選擇性的關(guān)鍵因素。本課題組研究發(fā)現(xiàn)3種土地利用方式土壤細(xì)菌對碳源相對利用率最高的是糖類（數(shù)據(jù)未列出），表明在本研究的供試土壤條件下真菌和細(xì)菌本身對碳源利用的選擇性明顯不同。PCA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同土地利用方式土壤真菌對碳源的利用存在顯著差異，說明不同土地利用方式明顯改變了土壤真菌群落對底物碳源的代謝特征。進(jìn)一步采用RDA對可能造成差異的因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，土壤理化性質(zhì)（總氮、含水量、有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷和硝態(tài)氮）與土壤真菌功能多樣性密切相關(guān)，說明不同土地利用方式導(dǎo)致土壤的理化性質(zhì)改變，進(jìn)而導(dǎo)致土壤真菌功能群落的不同。研究不同土地利用方式對土壤真菌功能多樣性的影響，可以從側(cè)面反映土壤基本理化性質(zhì)對土壤真菌功能多樣性的綜合作用。

4 結(jié)論

土壤真菌的活性和碳源的利用強(qiáng)度依次為草地＞林地＞耕地。3種土地利用方式土壤真菌功能多樣性和群落代謝特征不同，其土壤真菌群落結(jié)構(gòu)也有所不同。土壤真菌對碳源利用的偏好因土地利用方式而改變。土壤理化性質(zhì)的改變是導(dǎo)致真菌群落代謝特征變化的主要原因，其代謝特征變化主要受總氮、含水量、有機(jī)質(zhì)、pH、速效磷和硝態(tài)氮等因子的共同影響。雖然草地土壤真菌活性和多樣性等指標(biāo)均明顯高于林地和耕地，但按照因地制宜的環(huán)境改善策略，在吉林省丘陵區(qū)采用退耕還林的生態(tài)重建方案更符合當(dāng)?shù)貙?shí)際。